公开(公告)号 | CN1188516C |
公开(公告)日 | 2005.02.09 |
申请(专利)号 | CN99119166.8 |
申请日期 | 1999.09.17 |
专利名称 | 一种重组纳豆激酶的编码核苷酸序列及该酶的制备方法 |
主分类号 | C12N9/12 |
分类号 | C12N9/12;C12N15/70;C12N15/54;A61K38/45;A61P7/02 |
分案原申请号 | |
优先权 | |
申请(专利权)人 | 常荣山 |
发明(设计)人 | 常荣山 |
地址 | 100080 北京市海淀区苏州街18号长远天地A2座612室 |
颁证日 | |
国际申请 | |
进入国家日期 | |
专利代理机构 | |
代理人 | |
国省代码 | 北京;11 |
主权项 | 一种制备重组纳豆激酶的方法,包括纳豆激酶基因克隆的构建,在大肠杆菌中的表达,工程菌的发酵,表达产物重组纳豆激酶的纯化以及其生物活性的测定,其特征在于:(1)以枯草杆菌BacillussubtilisnottoAsl.1086菌体总DNA为模板,参考枯草杆菌中编码纳豆激酶EC.3.4.262的NAT基因序列设计引物,通过PCR方法直接扩增纳豆激酶基因,纳豆激酶基因克隆进pGEM-T载体后,经序列分析证实,然后与含有cIta857基因,PrPL启动子以及rrnB基因转录终止信号的原核表达载体pBV220质粒组装成高效表达载体pBV-NK;(2)pBV-NK转化大肠杆菌BL21-DE3,用温度诱导重组纳豆激酶基因的表达,表达产物以包涵体的形式存在于大肠杆菌BL21-DE3中;(3)通过发酵技术大规模培养大肠杆菌BL21-DE3,用温度诱导重组纳豆激酶基因表达,发酵参数为温度28℃-40℃,溶氧量为50%-80%,PH6-8;(4)发酵后用高压破碎细菌,离心收集破碎后的沉淀,将包涵体变性后,经凝胶过滤纯化包涵体,包涵体复性后,经离子交换法纯化重组纳豆激酶,进行活性测定后,冻干成粉末保存。 |
摘要 | 纳豆激酶是一种安全,高效的具有纤溶活性的酶制剂。目前已被深入研究,试图作为口服溶栓剂予以开发应用。我们利用基因工程的方法,表达出具有纤溶活性的纳豆激酶。重组产物和天然纳豆激酶相比,具有良好的生物学活性。体内和体外实验证明,纳豆激酶具有良好的溶解血栓作用和促进内源性t-PA的产生,从而直接和间接的促进了溶栓作用。同时由于纳豆激酶的安全性较高,没有出现大出血等现象,易于口服治疗。 |
国际公布 |