第七章 血液系统
第一节 血液凝固与抗凝
[实验目的]
（1)学习用玻片法测定凝血时间。
（2)观察家兔体外血凝、组织因子促凝和肝素抗凝过程，并分析各个过程度产生机制。
[实验动物]
家兔，体重2.0～2.5kg/只，雌雄不拘。
[药品、器材]
1． 药品
蒸馏水、生理盐水、3%戊巴比妥钠溶液（或25%氨基甲酸乙酯)、1250单位/ml的低分子量肝素钠溶液（临用时配制)、肺组织浸液（含组织因子)。
肺组织浸液制备方法：取新鲜兔肺，剪成小块，洗净血液。磨成糊状。加入3～4倍的生理盐水，摇匀放冰箱中过夜，大滤纸过滤后，即可得肺组织浸液，保存冰箱备用。
2．器材
兔常用手术器械一套、兔台、兔绳、玻璃分针、动脉小尼龙插管、动脉夹、缝合线、纱布；注射器：5ml注射器和7号针头各4个
干净、干燥的玻片：3块标记笔1支干净、干燥的大头针3根多功能秒表1个水浴恒温箱1个干净、干燥的取血小试管1个
[观察指标]
凝血时间测定（小时： 分钟： 秒： )
[方法、步骤]
1．实验前的准备
（1)打开水浴恒温箱，灌入适量的自来水至试管架的平面，恒温37 ℃。待用。
（2)取干净、干燥的玻片3块，编号，然后将玻片放入水浴恒温箱的试管架上，加温至37 执业医师℃，注意不要弄湿；
（3)动物准备
兔称重后，用3%戊巴比妥钠溶液1ml/kg体重（或25%氨基甲酸乙酯4ml/kg体重)麻醉，注射速度要慢；背位固定，行颈总动脉分离术和尼龙管插管术（暂不放血)。
（4)按表1中实验的项目在玻片上分别用不同的5ml注射（安装7号针头)加入相应的试剂。注意不要混淆。
表7-1家兔的体外血凝、抗凝和促凝因素对凝血时间的影响
| 凝血时间（小时： 分钟： 秒： ) |
| 1号玻片上加入肺组织浸液1滴： 2号玻片上加入生理盐水1滴： 3号玻片上加入肝素溶液1滴： |
2．凝血时间测定和记录时间
（1) 取干净、干燥的小试管1个，迅速放入动脉血2ml（注意：经小尼龙管放血时，第一滴已激活的血液弃掉)；
（2)取血后，立即用5ml注射器（安装7号针头)抽取血液少许，并在每块玻片的试剂上加入等量的1滴血液，在分别用大头针混匀（注意不要混淆)的同时立刻计时（注意首先记录1号玻片的凝血时间)。
（3) 每隔10秒，用大头针在各玻片的血液中，朝一个方向挑血丝，见到第一个血丝的出现，立即终止计时。从开始计时到终止计时的一段时间即为玻片法的凝血时间。请将该时间记录到表1中。
[注意事项]
（1)所用玻璃器皿要求干净、干燥。
（2)专用试剂、大头针和注射器不要混淆。
（3)计时要耐心、细心、和准确、因为第一凝血丝的出现是瞬间的。
（4)可利用第一节家兔的体外血凝、促凝和抗凝实验的兔、试剂注射器，继续做第二节家兔体内的微循环、促凝和抗凝实验)
[思考题]
（1)比较表1中各凝血时间，为什么时间有长短？
（2)在肺组织浸液促进血凝块出现后立即加入肝素溶液1滴，仔细观察兔凝血块是否能溶解？为什么？
第二节 急性弥散性血管内凝血
[实验目的]
（1)观察家兔体内肠系膜微循环的血液流动特点。
（2)观察组织因子在家兔体内促凝过程和肝素预防组织因子在家兔体内促凝过程，并分析各个的作用机制。
[实验动物]
家兔，体重2.0～2.5kg/只，雌雄不拘。
[药品、器材]
1．药品
蒸馏水、生理盐水、3%戊巴比妥钠溶液（或25%氨基甲酸乙酯)、低分子量肝素钠溶液（临用时，一支肝素溶液用生理盐水稀释10倍)、肺组织浸液。
2．器材
Compact-X型全自动血液凝集分析仪；BL--2000型微循环观察仪；手术器械一套、兔台、兔绳、玻璃分针、动脉小尼龙插管、动脉夹、缝合线、纱布，5ml注射器3个、1ml注射器1个，计时钟。
[观察指标]
（1)肠系膜微循环凝血时间测定（小时： 分钟： 秒： )，计时从注射试剂开始到血流停止为止。凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、 凝血酶时间(TT)/ 爬虫酶时间、 纤维蛋白原(FIB)、凝血因子浓度(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)、抗Ⅹa因子肝素检测、D二聚体。
（2)呼吸频率（次/分)
（3)嘴唇、黏膜的发绀情况
[方法、步骤]
1．家兔肠招生简章系膜微循环暴露手术
在兔右腹侧部（近兔台处)作一平行于兔身体纵轴的约2cm长的切口，打开腹腔，轻轻拿出一小段小肠，找出肠系膜的透明部分，将其置于低倍显微镜下，找到微循环血液流速很快的部分，并在高倍镜下进一步找到含有数根仅有单个细胞通过的毛细血管的肠系膜，固定该视野，以便观察其变化。（用湿润的生理盐水纱布轻轻盖在肠系膜上)
2．续用第一节实验的兔三只，分别编号1、2、3。做以下实验：
（1) 注射生理盐水组：在2min内给1号兔缓慢静脉注射生理盐水4 ml；
（2) 肺组织浸液促凝组：在2min内给2号兔缓慢静脉注射生理盐水2 ml和肺组织浸液2ml；
（3) 肝素溶液抗凝组： 在2min内给3号兔缓慢静脉注射肝素溶液2mlml肺组织浸液2ml。
表7-2家兔的体内血凝、促凝和抗凝因素对凝血时间、呼吸及发绀的影响的结果记录
| 凝血时间（小时： 分钟： 秒： ) | 呼吸（次/分)、发绀
|
| 生理盐水组 肺组织浸液促凝组 肝素溶液抗凝组 |
[注意事项]
（1)手术中要注意及时止血。
（2)微循环观察部分不能移动、不能人为损伤和出血。
[思考题]
（1)比较三组的微循环情况，是否都有凝血？为什么？
（2)在肺组织浸液促凝组凝血后立即缓慢注射注射肝素溶液2ml，仔细观察兔肠系膜微循环凝血情况是否能改善？为什么？
（3)在肺组织浸液促凝组凝血后若兔继续存活，仔细观察1～3小时后兔肠系膜微循环是否发生多处毛细血管壁破裂、出血现象即弥漫性血管内凝血（DIC)现象。DIC 怎样预防？
第三节 血药浓度半衰期测定
［实验目的］
（1)掌握t1/2比色测定法。（2)了解药物血浆A（t1/2)、生物利用度和表观分布容积等概念。
（3)学会绘制药物时—量曲线。
[实验动物］
家兔，性别不拘。
［药品、器材］
723型分光光度计、离心机、手术器械一套、注射器、2号注射针头、动脉插管、动脉夹、微量定量移液管、试管架、大号试管、吸管、洗耳球。
3％戊巴比妥钠、125单位/ml 肝素生理盐水、20％磺胺嘧啶钠（SD)、6％三氯醋酸、0．5％亚硝酸钠、0．5％麝香草酚氢氧化钠溶液。
［观察指标］
吸光度值。
［方法、步骤］
1．标准曲线的制备。
（1)SD标准液配制，按下列步骤：
a．取20％SD溶液2．56毫升置于200毫升容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此浓度即128mg／100m1。
b．取上清液7．5m1用蒸馏水稀释至10m1。这时SD的浓度96mg／100m1。
c．取浓度为128mg／100m1SD溶液100ml倍稀释分别获得64mg／100m1、32mg／100m1、16mg／l00m1、8mg／100m1SD溶液。
（2)取试管7支，编号。每支试管内加6％三氯醋酸7．8ml，再分别加入不同浓度的SD标准液０．2m1(6支内)，另1支加入0．2mI蒸馏水。贴上标签、混匀。
（3)再取试管7支，编号。按表7—1依次加入各种溶液后充分摇匀。
（4)用721型分光光度计比色，选择520nm波长，读出各试管光密度。
（5)以SD深度为横坐标，光密度为纵坐标作标准曲线。
2．血标本制备：取家兔一只，称重，用3％戊巴比妥钠1ml／kg耳缘静脉注射麻醉，麻醉后固定，施颈部切开术，颈总动脉插管以备放血时用。耳缘静脉注射0．5％肝素1m1／kg，5分钟后放血0.5m1，同时注入20％SD溶液2m1／kg。分别于给药后的第0、5、10、20、30、40、60分钟时放血0.5m1。
取离心管8支，加入6％三氯醋酸7．8m1，然后从0．5m1各血样本中准确吸取0.2ml于离心管，混匀，离心(1500转，5分钟)，分别取上清液于另外8支试管中，待用。
2． 比色测定
3． 按表7—2进行。
表7-3 标准曲线的制备
| 7 空白 | 6 （8mg/ 100ml) | 5 (16mg/ 100ml) | 4 (32mg/ 100ml) | 3 (64mg/ 100ml) | 2 (90mg/ 100ml) | 1 (128mg/ 100ml) | |
| ②步中标准液（ml) ②步中蒸馏水（ml) 0.5%亚硝酸钠（ml) 0.5%麝香草酚（ml) | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 |
表7-4
| 空白管 | 待测管 | |
| 给药前上清液(m1) 给药后上清液(m1) 0.5％亚硝酸纳(m1) 0.5％麝香草酚(m1) | 3 1 2 | 3 1 2 |
用723型分光光度计进行比色，选择520nm波长，读出吸光度(A)值。将结果填入表6-3
表7-5给药后不同时间兔血SD浓度
| 0′ | 5′ | 10′ | 20′ | 30′ | 40′ | 60′ | |
| 光密度(A) 浓 度(C) 浓度对数(lgC) |
要求： 1．以时间为横坐标，血药浓度的对数为纵坐标，绘制t—lgc曲线。
2．从t—lgc曲线上取两点，按下式计算出SD的血浆浓度半衰期：
t1/2= 0.301
(lgC1—lgＣ2)/Δt
3．按下式计算表观分布容积：
Vd = A(mg)
Co(mg／ml)
4．按下式计算生物利用度：
F＝ 吸入体循环药量
给药总量×100%
［注意事项］
1．给SD时一定要注入静脉内，若注射至皮下将会影响t1／2测定。
2．每次取血前先将插管中残血放掉。
3．每吸取一个血样时，必须更换吸嘴。
4．操作程序不得颠倒，每次加试剂后必须混匀。
5．采血时间不准时，应记录实际时间。
6．血液加到装三氯醋酸试管内立即振摇，否则易出现凝血块。
［思考题］
1．试述t1／2、Vd、F的定义和意义。
2．某药的最低有效血浓度为2．0mg/100m1，t1／2为10.7小时。测得患者血药浓度4.7mg/100m1，试问尚能保持有效浓度几小时?(计算公式Ct＝Co×0.5t/t1 / 2)
（谢志忠 廖端芳)
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凝血前 凝血后