| 公开(公告)号 | CN101003816A |
| 公开(公告)日 | 2007.07.25 |
| 申请(专利)号 | CN200710008445.4 |
| 申请日期 | 2007.01.11 |
| 专利名称 | 人PEX分泌型真核表达质粒的构建方法及其应用 |
| 主分类号 | C12N15/85(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/85(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 厦门大学 |
| 发明(设计)人 | 吕文清 |
| 地址 | 361005福建省厦门市思明南路422号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 厦门南强之路专利事务所 |
| 代理人 | 陈永秀;马应森 |
| 国省代码 | 福建;35 |
| 主权项 | 人PEX分泌型真核表达质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤： 步骤1、pGEX-4T-3/PEX215质粒的构建 (1)以从胎盘提取的组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链； (2)根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和载体pGEX-4T-3(AmershamBiosciences公司产品)的多克隆位点，设计PCR引物PEX446S：序列为5’-CTG AAT TCC TCTCCT GAC ATT GAC CTT G-3’，上游引物，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；PEX660A：序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，下游引物，带限制性内切酶Xho I酶切位点； (3)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段，并重组入载体pGEX-4T-3中，得编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段PEX215； (4)将PEX215重组于GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-3，获得序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215； 步骤2、PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA 根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其编码框架以及pSecTag A载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense，其中上游引物PEX466sense，序列为5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’，带限制性内切酶Sfi I酶切位点；下游引物PEX660antisense，序列为5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点；以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板，用引物PEX466sense与PEX660antisense一起扩增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的PEX蛋白； 步骤3、真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建 将PCR扩增的PEX cDNA片段和载体pSecTag A经Sfi I和XhoI双酶切后，经连接酶连接后构建质粒pSecTag A/PEX，该质粒表达的PEX蛋白N端带有Ig κ-链前导链，C端带有Myc表位标签，Ig κ-链前导肽可介导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性PEX蛋白的检测以区别于内源性PEX蛋白。 |
| 摘要 | 人PEX分泌型真核表达质粒的构建方法及其应用，涉及一种真核表达质粒。根据人MMP2序列及其编码框架以及pSecTag A载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense，以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板，以PCR技术扩增人MMP2C端片段PEXcDNA，再构建真核表达质粒pSecTag A/PEX。构建方法更加简捷，同时用人PEX cDNA作为插入片段构建的真核表达载体更有利于人PEX细胞功能研究和相关应用研究。所构建的质粒可作为一种基因治疗药物用于肿瘤等相关疾病的治疗。 |
| 国际公布 |
