| 公开(公告)号 | CN1242065C |
| 公开(公告)日 | 2006.02.15 |
| 申请(专利)号 | CN200310112770.7 |
| 申请日期 | 2003.12.26 |
| 专利名称 | 猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒和疫苗 |
| 主分类号 | C12N15/861(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/861(2006.01)I;C12N7/08(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/33(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;A61K39/235(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 南京农业大学 |
| 发明(设计)人 | 姜 平;李玉峰 |
| 地址 | 210095江苏省南京市卫岗1号南京农业大学科技处钱宝英 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 南京经纬专利商标代理有限公司 |
| 代理人 | 楼高潮 |
| 国省代码 | 江苏;32 |
| 主权项 | 猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的：(1)GP5基因的扩增、克隆根据PRRSV美洲标准毒株ATCCVR-2332的基因序列设计了一对针对PRRSV国内分离株S1毒株GP5基因的特异性引物，引物序列如下：AdGP5.1：5-GCCGGTACCACCATGTTGGAGAAATGCTTGAC-3AdGP5.2：5-GCACTCGAGCTAAGGACGACCCCATTGTTC-3以S1毒株感染的Marc-145细胞的cDNA产物为模板，应用RT-PCR技术扩增出了PRRSV国内分离株S1毒株的GP5全基因，在引物的5’端分别含有限制性内切酶酶切位点，通过这两个酶切位点，把GP5基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5；(2)含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有GP5基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨架载体，经50g/ml卡那霉素筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒；(3)重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293-A细胞，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-GP5。 |
| 摘要 | 本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒和疫苗属于高新生物技术领域。通过RT-PCR技术扩增PRRSV GP5全基因序列，并把该基因序列克隆入腺病毒载体系统的穿梭载体pShuttle-CMV中，与腺病毒载体系统的骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183菌株获得重组质粒，重组质粒转染HEK293-A细胞获得了重组腺病毒并成功的进行了噬斑纯化，通过RT-PCR和间接免疫荧光技术证明构建成功表达了PRRSV GP5蛋白的重组腺病毒rAd-GP5。在该重组毒中可以使PRRSV的GP5蛋白表达提前和表达量提高，能更有效的刺激机体的免疫保护反应。这种重组腺病毒疫苗具有亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗的抗原增殖能力，能够刺激机体全方位的免疫应答，从而具有广泛的开发和应用前景。 |
| 国际公布 |
