| 公开(公告)号 | CN100336912C |
| 公开(公告)日 | 2007.09.12 |
| 申请(专利)号 | CN200510012425.5 |
| 申请日期 | 2005.03.25 |
| 专利名称 | 利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法 |
| 主分类号 | C12P21/02(2006.01)I |
| 分类号 | C12P21/02(2006.01)I;C12R1/19(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 深圳国家生化工程技术开发中心 |
| 发明(设计)人 | 林 枫;于志江;王玉树;周兆平;章 刚;陈 旭;梁四五;姚小建;骆晓栋;欧阳藩 |
| 地址 | 518057广东省深圳市深南大道市高新技术工业村W2-A2 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 深圳市智科友专利商标事务所 |
| 代理人 | 曲家彬 |
| 国省代码 | 广东;44 |
| 主权项 | 利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤：A、将斜面菌种经扩大培养制成种子液；所述的将斜面菌种经二级扩大培养制备成种子液，其中第一级扩大培养中发酵培养基组成为：胰蛋白胨6-15g/L，酵母粉3-8g/L，氯化钠4-6g/L，氨苄青霉素50-200mg/L；接种量1-2％，培养温度为28-32℃，培养周期为6-10小时；第二级扩大培养中培养基选用甘油培养基，该培养基由下列成份组成：胰蛋白胨12-18g/L，酵母粉8-15g/L，氯化钠5g/L，甘油5-10g/L；接种量1-2％，培养温度28-32℃，培养周期12-18小时；B、将A步骤中制备的种子液按种子液：发酵培养基按2-5％的比例接种于发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列体积重量份的组分：甘油3-8g/L，胰蛋白胨4-10g/L，酵母粉2-6g/L，KH2PO44-10g/L，K2HPO46-12g/L，(NH4)2SO41-4g/L，MgCl20.5-2g/L，微量元素1ml/L；培养温度为28-32℃，培养15-20小时后诱导，诱导温度为41-43℃，诱导时间4-6小时；升温诱导之前，将菌体的平均比生长速率控制在0.2～0.4；所述的微量元素由下列成份组成：FeSO4·7H2O1-3g/L，CoCl2·6H2O2-4g/L，MnCl2·4H2O1-3g/L，CuSO43-8g/L，ZnSO41-4g/L，EDTA2-5g/L，H3BO33-6g/L，Na2MoO4·2H2O1.5-5g/L；发酵过程中细菌增殖阶段的pH值控制在6.9-7.1，在目的基因表达阶段的pH值为7.1-7.3，通气量为0.5～1.5VVM，发酵过程的溶解氧浓度为15％-50％，并进行补料，控制补料速率与菌体的消耗速率相当，使发酵液中的甘油浓度维持在1.0～3.0g/L；发酵液经离心收集菌体，离心条件为3500-5000rpm，4-10℃，15-20分钟，发酵周期为19-26小时；所述的补料方式为对数流加方式，补料培养基由下列成份组成：甘油100-500g/L，酵母粉20-60g/L，胰蛋白胨20-50g/L，(NH4)2SO410-50g/L，MgSO48-20g/L；C、纯化(1)包涵体的提取：将B步骤中收集的菌体按1∶5-10的比例用缓冲液重悬，缓冲液组成为150-250mMNaCl，10-50mMTris-HCl，1mMEDTA-Na2，PH7.5-9.0，冰水浴，用均质机以600-700bar压力匀浆，离心，收集包涵体沉淀；用缓冲液洗涤包涵体1-2次，该缓冲液组成为2M尿素，150-250mMNaCl，10-50mMTris-HCl，1mMEDTA-Na2，PH7.5-9.0，使其SDS-PAGE纯度达到60％以上；将包涵体按1∶20-40的比例加入裂解液，室温搅拌5-8小时，离心，离心条件为8000-11000rpm，4-25℃，15-30分钟，弃沉淀，取上清；所述的裂解液为8M尿素，50mMTris，PH8.3；(2)融合蛋白提取：用Sepharose6FF疏水层析提取融合蛋白，将(1)步骤中的上清液直接上样或用2.2M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0稀释一倍后上样，以2M尿素，0.4M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0洗脱，280nm紫外检测，收集目标峰中的第一峰；(3)rhANP初步纯化：将步骤(2)中的疏水层析收集物用缓冲液稀释，该缓冲液组成为10-50mMTris-HCl，150-250mMNaCl，PH8.0-9.0，按每毫克融合蛋白用1-5单位凝血酶的用量加入凝血酶，于28-35℃反应4-10小时；以0.1M乙酸-乙酸胺，150-250mMNaCl，0-25％乙腈为流动相，用Superdex30pg分离，收集目标峰；(4)rhANP精细纯化：采用高效液相色谱柱，流动相A为6％乙腈，0.05％-0.1％TFA，流动相B为30％乙腈，0.05％-0.1％TFA，进行洗脱；收集目标峰，去除乙腈和TFA，即为纯化的rhANP；发酵菌种选用大肠杆菌遗传工程菌株——pCW112-ANP/DH5α。 |
| 摘要 | 本发明属于生物发酵技术领域，特别是利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法。本发明利用大肠杆菌遗传工程菌株——pCW112-ANP/DH5α经过斜面菌种、扩大培养制备种子液、高密度发酵、分离纯化等工艺步骤制备纯化的重组人心钠肽-rhANP。本发明解决了ANP的表达和纯化比较困难，因而限制了ANP的产业化应用的问题，具有成本低、原料与菌种易得、操作简单，且生产条件易于控制、重复性好的优点，所制备的产物可有效的适于制药领域的应用。 |
| 国际公布 |
