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1.2 T细胞的分离培养 取正常健康志愿者外周血5mL于肝素抗凝管中，加入RosetteSep人T细胞富集抗体混合液(50mL/L全血)，充分混匀,室温静置30min，以等倍体积PBS稀释，充分混匀后小心加到淋巴分离液上，以20℃、2000r/min离心20min，取中间单核细胞层，用PBS液洗两次(4℃、1500r/min 15min)，然后用RPMI1640完全培养液调整细胞数为2×109～4×109/L。
1.3 潮霉素筛选浓度的确定 于6孔板中，接种T细胞3.0×105/孔，加含100mL/L FBS的DMEM培养基2mL，分别加入50g/L的潮霉素2、4、6、8、10、12μL，潮霉素终末质量浓度依次为50、100、150、200、250、300mg/L，37℃培养。每3d换液1次。显微镜下观察细胞的生长状况，以第8天能杀死孔内所有T细胞的潮霉素浓度确定为筛选浓度医.学.全.在.线www.med126.com。
1.4 脂质体介导的T细胞的稳定转染 转染前24h，在6孔板内按1×106细胞/孔接种细胞，转染方法按试剂说明书进行。3周后将稳定生长的细胞克隆逐次转移至24孔板、6孔板和培养瓶中扩大培养，获得整合有pSilencer3.1H1重组质粒并能稳定表达siRNA1和siRNA2的单克隆细胞株。
1.5 细胞生长曲线的绘制 将已转染了siRNA1和siRNA2的单克隆细胞株制备单细胞悬液，接种96孔板，设5个复孔，37℃、50mL/L CO2条件下培养。设正常人T细胞作为对照组。1、2、3、4、5、6、7d时，弃液，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h后弃液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm的吸光度值。以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.6 RTPCR检测TGFβⅡR的表达 根据人TGFβⅡR的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计了扩增TGFβⅡR的RTPCR引物P1和P2，以βactin作为内参照。引物由上海Sangon公司合成。βactin：5′CTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′，5′ C
TCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′，520bp，退火温度52℃;TGFβⅡR：5′ TTTCCACCTGTGAC
AACC 3′，5′ TGACAGATATGGCAACTC 3′，346bp，退火温度55℃。按照TRIZOL说明书提取细胞总RNA。按照RTPCR试剂盒说明书,将mRNA逆转录为cDNA,再将所得的cDNA进行PCR扩增。取5μL PCR反应产物，经过15g/L琼脂糖凝胶电泳后,在紫外投射反射仪下观察结果。采用DNA MarkerⅠ作为DNA长度标志。通过凝胶图像成像分析系统,以目的基因的PCR扩增片段灰度与相应的内参βactin扩增片段灰度的比值作为其mRNA表达水平的相对参数。
1.7 Western blot检测TGFβⅡR的表达 选取一抗为兔抗人TGFβⅡR多抗，二抗为生物素化山羊抗兔IgG。严格按照ECL Western blot试剂盒说明书步骤操作。
1.8 人牙周膜细胞的分离培养 选取11～14岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，用PBS液反复冲洗，无菌条件下刮取牙根中1/3的牙周膜组织，剪碎后用2.0×105u/L Ⅰ型胶原酶37℃消化1h，800r/min离心5min，弃上清;用无血清DMEM培养液悬浮组织，800r/min离心5min，弃上清;加适量含100mL/L新生牛血清的DMEM培养液，连同组织块转至6孔板，37℃，950mL/L空气、50mL/L CO2、100%湿度条件下培养。每2～3d换液1次。取第5～8代细胞用于实验。免疫组化法检测波形丝蛋白和角蛋白抗体以鉴定细胞来源。
1.9 实验分组 将转染与未转染靶向性TGFβ ⅡR基因沉默的T细胞与人牙周膜细胞置于含有1.0g/L的LPS(美国Sigma公司，按说明书配制)和1.0mg/L黄芩苷溶液(中国药品生物制品检定所，精密称取干燥至恒重的黄芩苷标准品5.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，再将其浓度稀释至1.0mg/L)的培养基中，共培养48h。实验分为6组：①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞.
