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KEY WORDS: transforming growth factor βⅡ receptor (TGFβRⅡ); small interfering RNA(siRNA); receptor activator of nuclear factorκB ligand (RANKL); osteoprotegerin (OPG); periodontal ligament cells (PDLC)
骨保护素(osteoprotegerin, OPG)及其配体核因子κB受体激活物配基(receptor activator of nuclear factorκB ligand, RANKL)是调控破骨细胞生成和活化的关键因子，在调节骨质吸收中发挥着重要作用。研究发现OPGRANKL能在人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cell, PDLC)表达，并受多种因素调节[13]。在口腔局部微环境中,众多因素通过作用于牙周组织，使OPG与RANKL的浓度增加或减少来调控局部骨组织代谢。
细菌激发的诉诸免疫炎症反应是造成和影响牙周组织破坏的主要原因。黄芩苷的抗炎作用则决定了其在牙周病的防治中可能起到重要作用。有研究证实，黄芩苷、淫羊霍苷和大黄素组合时可抑制内毒素(LPS)刺激下人牙龈成纤维细胞中前列腺素E2(PGE2)的产生，亦可抑制实验性牙周炎牙槽骨吸收[4]。本研究的第一个目的，即拟通过观察黄芩苷对PDLC上OPGRANKL表达的影响，从而证实黄芩苷对牙槽骨的吸收的调节作用医.学.全.在.线www.med126.com。
牙周炎时，T细胞的数量、活性增高，导致炎症细胞因子分泌增加，加重牙周炎症和骨吸收。转化生长因子β(transforming growth factor β, TGFβ)可以抑制T细胞的活性和增殖[56]。黄芩苷抗炎作用的机制也与抑制白介素1(IL1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等炎性因子的过度产生有关[78]，因而设想黄芩苷的抗炎抗骨吸收作用可能是通过TGFβ实现的。本研究的第二个目的，即黄芩苷是否通过增强TGFβ对T细胞的抑制作用，引起T细胞活性降低、数量减少，导致T细胞在内毒素作用下分泌TNFα等炎症因子减少，继而影响OPGRANKL，降低破骨细胞形成，从而减少骨丢失。
为达到以上两个研究目的，本实验首先构建了靶向转化生长因子βⅡ型受体(transforming growth factor βⅡreceptor, TGFβⅡR)的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)真核表达载体，并将其转染T细胞，随后将正常PDLC与转染或未转染siRNA的T细胞置于加有内毒素和黄芩苷的培养液中，观察黄芩苷对正常PDLC上OPGRANKL表达的影响。
1 材料与方法
1.1 TGFβⅡR靶向siRNA真核表达载体的构建 根据GenBank中报道的TGFβⅡR核苷酸序列，参考siRNA的设计原则，按照pSilencer3.1H1载体的设计要求，设计2条siRNA序列。TGFβⅡR siRNA转录模板由北京华大公司合成，RNAi TGFβⅡR目标序列依次为：5′GATCCGCAGCAT
GTGTATAGCTGAATTCAAGAGATTCAGCTA
TACACATGCTGCTTTTTTGGAAA3′和5′GA
TCCGCCAGCCATTGCTCATAGATTCAAGAG
ATCTATGAGCAATGGCTGGCTTTTTTGGAA
A3′，分别命名为siRNA1和siRNA2。两个片段直接与经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pSilencer3.1H1载体连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，摇菌培养后提取质粒，送北京华大公司进行序列测定。将测序正确的克隆分别命名为siRNA1和siRNA2。
