七 高效液相色谱法
高效液相色谱（HPLC)又叫高压、高速、近代液相柱色谱，但常叫做高效液相色谱。它是20世纪60年代中期才建立的一个高效快速分离化合物的方法，广泛地用在生物大分子的分离和纯化方面。在分离生物大分子时HPLC与经典的柱液相色谱比较具有以下几个优点 ①分辨率高：一根长10cm的柱子可以分离十几种以上的物质；②速度快：物质的分离与纯化一般在1h内就可以完成，甚至只需要几分钟时间，其流速一般为1～10ml／min或更高；③重复性好：HPLC在分析生物大分子时结果误差小于５％；④适用面广，灵活性强：几乎所有的生物大分子根据它们的性质差别（等电点、疏水性、相对分子质量、电荷分布等)都可以使用不同的HPLC方法进行分离提纯，在一定的条件下，还可以保持其高的生物学活性，且极易回收；⑤灵敏度高：HPLC已广泛采用高灵敏的检测器，加上仪器本身集分离和富集于一身，使生物大分子的最小检测下限非常低。紫外一般可达10-7ｇ，荧光可达10-9ｇ。这些是HPLCＨＰＬＣ特有的优点，使它在近年生物大分子的分离和纯化方面占据了极其重要的地位。
(一)原理
HPLC法的分离原理与经典色谱（即层析法)相同，主要是各种溶质在色谱柱中，差速迁移的结果。这种差速迁移现象，是样品在固定相和流动相之间分配不同所引起的。
按照分离机制，可将其分为：
（１)高效离子交换色谱（HPIEC)（２)高效反相色谱（HPRPC)（３)高效疏水作用色谱（HPHIC)（４)高效排阻色谱（HPSEC)（５)高效亲和色谱（HPAC)。它们的主要特性见表。
生物大分子在不同ＨＰＬＣ上的分离机制及其操作条件间的关系
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色谱类型 |
分离机制 |
操作条件 |
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固定相上的基团 |
流动相 |
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HPIEC |
静电作用和电荷分布 |
带电荷的阴、阳离子 |
盐水溶液 |
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HPHIC盐水 |
疏水作用 |
极性非极性相间 |
有机溶剂（弱极性或非极性溶液 |
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HPRPC |
疏水作用 |
非极性 |
有机溶剂、水 |
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HPSEC |
分子大小和形状 |
惰性 |
盐水或有机溶剂、水 |
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HPAC |
分子间特异的亲和力 |
亲和配体 |
盐水溶液 |
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(二)高效液相色谱仪
高效液相色谱仪是20世纪60年代后期发展起来的一种分析仪器。设备中的基本部件有输液泵、色谱柱和检测器。但为了能得心应手地工作，仪器应当适应多功能的要求，同时配有梯度装置、部分收集器、恒温系统、数据处理系统以及控制系统等部件。
１．贮液装置 贮液装置是用来贮存足够数量的洗脱液，供分离物质之用。商品型是用不锈钢制成，常附有脱气设备，如搅拌、加热、抽真空、吹氮气等。医 学全,在线.搜集.整理
www.med126.com自制可用玻璃瓶代替。
２．输液泵 泵是HPLC设备中重要的部件，是驱动溶剂和样品通过色谱分离柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响整个仪器和分析结果的可靠性
３．梯度洗脱装置 梯度洗脱是利用两种或两种以上的溶剂，按照一定时间程序来改变配比浓度，以达到提高洗脱能力、改善分离效率的一种有效方法。梯度洗脱技术在高效液相色谱分离生物大分子中有很重要的实用价值，特别在分离多组分的生物大分子样品时，各组分的k′值相差很大，很难用一种固定配比浓度的溶剂获得良好的分离，无法将各组分的
k′都控制在有效的范围内。采用梯度洗脱可以按一定程序，改变溶剂的极性和洗脱强度，使各组分k′值均可控制在最佳条件，不但能提高分离效果和改善峰形，而且可缩短分析时间。梯度洗脱中，后被洗脱的组分比它在相应的等浓度洗脱中的峰形更尖锐，因此检测的灵敏度更高。
４．色谱柱 色谱柱是HPLC的核心部件，要求分离度高，柱容量大，分析速度快，而这些性能不仅与柱填料有关，也和它的结构、装填、使用技术有关。
理论上，色谱柱越长，柱的分离效果越好，但由于固定相的粒度对柱长产生了限制，在目前的条件下，只能保证10～25cm长的柱子可获得好的重现性和结果。色谱柱的内径国外常采用4.6mm，国内常采用5mm。随着色谱，技术的发展，内径2mm的色谱柱已作为常用柱径，因为，它可以获得与粗径色谱柱基本相同的分离效果，而其溶剂的消耗量仅为5mm柱子的1／6。
５．进样器 待分析样品从柱前的进样器进样，可用注射器进样、阀进样和自动进样器进样三种。其中注射器进样和阀进样最为常用。
６．检测器 被分析的组分从柱子流出以后该组分在流动相总的浓度的变化可通过检测器转化为电信号或光信号而被检出。检测器必须具有足够灵敏度，而且适应条件范围比较广泛。最常用的检测器：
（１)紫外吸收检测器 凡是有紫外吸收的化合物都可以使用。
（２)示差折光检测器 多用于脂质、糖类物质的测定，缺点是对温度特敏感。
（３)荧光检测器 是一种受干扰小，灵敏度很高的测验器，只要能在紫外光激发下发射荧光的溶质都可以使用，适用于各种氨基酸、胺类维生素、甾醇化合物的测定。
(三)色谱方法的选择
待分离样品对色谱法的选择主要基于样品的物理化学特性及溶解度。对于一个未知样品，首先要大概了解它的分子大小，然后进一步试验其溶解性能。根据分子大小和溶解性能便可粗略地选定一种色谱柱进行初分。
一般来说，吸附色谱法多适用于非极性样品，它的柱容量主要决定于吸附剂表面的大小。离子交换色谱法和液－液分配色谱法多用于水溶性样品。柱容量分别决定于离子交换量和固定相中固定液的体积。凝胶过滤色谱法可根据填料的性能不同分别用于亲水和亲脂性样品。但以上选择也不能绝对化，如吸附色谱的填料经过特殊处理后也可以吸附很强的不溶性化合物，液－液分配色谱的正相和反相就可以分别用于分离极性和非极性化合物。关于对色谱方法的选择，可结合有关色谱专业书籍参考选择。
(四)操作及注意事项
１、进样前准备工作 各种溶剂一般要求新鲜配制，使用前要脱气处理，样品进样前，必须用流动相充分清洗柱平衡系统。样品用与流动相相同或互溶的溶剂完全溶解。医学全在线,搜集整,理
www.med126.com进样前样品要用微孔过滤器过滤。
２、洗脱 进样后洗脱条件常按事先计划好的溶剂程序进行。
３、柱的清洗及保存 色谱分离完毕后，要用溶剂彻底清洗色谱柱，或色谱柱用后存放时间过久也应定期清洗。
HPLC法的应用，除了认真了解仪器的设计原理和各种色谱柱的性质、应用范围外，要真正掌握好这门技术，还要通过大量实验才能得心应手。目前国内外HPLC仪和色谱柱型号繁多，每个厂家对自己的产品都有比较详细说明和应用举例，只要遵守操作规则及结合有关色谱的原理加以具体运用，在短期内掌握仪器操作开展实验工作是不困难的。
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