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一 基本原理
(一)原理
层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一，它是利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)的差异，在物质经过两相（一个固定相，一个流动相)组成的体系中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分离。配合相应的化学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质。层析法的特点是分离率、灵敏度、选择性均很高的一种分离方法。尤其适合样品含量少，而杂质含量多的复杂生物样品的分析。固定相可以是固体也可以是被固体或凝胶所支持的液体；同样流动相可以是液体也可是气体。
(二)分类
按分离的原理可分为五类：
１、吸附层析： 固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。
２、分配层析： 固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。
３、离子交换层析： 固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。
４、凝胶层析： 固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞程度不同而进行分离。
５、亲和层析：根据生物特异性吸附进行分离，固定相只能和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力者结合，而与无结合能力的其它组分分离。
按操作方式不同分为三类：
１、纸层析 以滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。
２、薄层层析 以一定颗粒度的不溶性物质，均匀涂铺在薄板上。点样后，用流动相展开，使组分达到分离。
３、柱层析 将固定相装柱后，使样品沿一个方向移动，以达到分离目的。
二 吸附层析
(一)原理
吸附作用是指某些物质（称吸附剂)能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象。吸附剂吸附能力的强弱除决定于吸附剂和被吸附物质本身的性质外，还和周围溶液的组成有密切关系。当改变吸附剂周围溶液的成分时，吸附剂的吸附能力即可发生变化，往往可使能吸附物质从吸附剂上解吸下来，这种解吸过程称为洗脱或展层。当样品中的物质被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液冲洗，就能改变吸附剂的吸附能力，使被吸附的物质解吸下来，随着洗脱液向前移动，该物质又遇到前面新的吸附剂而再次被吸附，在后来的洗脱液的冲洗下又重新解吸下来，继续向前移动。经过这样反复的吸附—解吸附—再吸附—再解吸的过程，物质就可以不断向前移动。由于吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，它们在洗脱剂的冲洗下移动的速度也就不同，因而能逐渐分离开来。
(二)吸附剂的选择
吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素等。硅胶为微酸性吸附剂，适合分离酸性和中性物质；氧化铝是微碱性吸附剂，适合分离碱性和中性物质；硅藻土和纤维素为中性吸附剂，适合分离中性物质。www.med126.com吸附剂的颗粒应有一定细度，并且粒度要均匀。一般颗粒直径为无机类0.07～0.1mm（150～200目)；有机类0.1～0.2mm（70～140目)。颗粒太粗，层析时溶剂推进快，但分离效果差，而颗粒太细，展开太慢，易产生斑点不集中并有拖尾现象。
(三)吸附能力
一般用活度来表示吸附剂的吸附能力，吸附能力主要受吸附剂含水量的影响，其由强到弱的程度以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。吸附剂活度强时能吸附极性较小的基团；吸附剂活度弱时对非极性基团吸附能力也较强。一般利用加热烘干的方法，减少吸附剂的水份，从而增加其活度。通常，分离水溶性物质时，因其本身具有较强极性，故吸附剂活度要弱一些；相反，分离脂溶性物质时，吸附剂活度要强一些。
吸附层析根据吸附剂的装填方式可分为柱层析和薄层层析法两种。
（１)吸附柱层析法 选择一根适当尺寸的玻璃管，在管的底部垫以尼龙网、玻璃棉或烧结玻璃板等，再填装一定量的吸附剂，然后在顶部加入样品溶液，待样品全部流入吸附剂内后，再加入洗脱液进行洗脱，不同组分即以不同的速度向下流动而逐渐分离开来。最后从下端出口处流出，分步收集洗脱液，即可得到各组分的溶液，供进一步处理和测定。
（２)吸附薄层层析法 薄层层析法是把吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层。把要分析的样品加在薄层的一端，在密闭的容器中，用适当的溶剂展层后达到分离、鉴定的目的。
薄层层析的优点是：设备简单、操作容易、层析时间短、分离效率高，是发展较快的一种微量，快速的层析方法，可用于氨基酸、核苷酸、糖类、脂类和激素等物质的分离和鉴定。
薄层层析的操作方法包括制薄板、点样、展层、显色等过程，薄层经显色确定斑点位置后，计算Rf值。然后与文献记载的Rf值比较以鉴定各种物质。
