五 凝胶层析
(一)原理
凝胶层析是20世纪60年代发展起来的一种分离分析方法。其法有许多同义词，如凝胶过滤、分子筛过滤、凝胶渗透层析等。
凝胶层析是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。凝胶的孔隙犹如“筛眼”。当被分离的物质流过凝胶柱时，分子大于凝胶“筛眼”范围的物质完全被排阻，不能进入凝胶颗粒内部，只能随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此受到的阻滞作用小，流程短，流速快而先流出层析柱；分子小于“筛眼”的物质则可完全渗入凝胶颗粒的“筛眼”中。因此，受到的阻滞作用大，而且从一个颗粒的“筛眼”又进入另一颗粒的“筛眼”，其流程长，流速也就慢，从层析柱中流出就较晚。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
www.med126.com从流出先后次序的不同即可达到分离和纯化被分离物质的目的。
凝胶的这种特性又称分子筛效应。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为Vo时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi，能全部透入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为Vo＋Vi时出现洗脱峰，介于其间的分子将在洗脱体积为Vo＋Ve时，出现洗脱峰。
我们将分子筛分配系数定义为：Ｋ=Ve／Vi
若生物大分子的分子为球形，其Ｋ与生物大分子的相对分子质量Mr存在如下关系：
K=-blgMr＋ｃ
其中ｂ和ｃ为常数。实验已证实这一关系的存在。
(二)凝胶的种类
用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖。
１、交联葡聚糖凝胶
交联葡聚糖商品名为Sephadex，它的原料是细菌分泌的链状葡聚糖。通过交联剂1-氯代-2,3-环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也就越小；反之越大。商品Sephadex以Ｇ值表示不同交联度，Ｇ值越大，空穴也越大，Ｇ后边的数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍，Ｇ-25表示每克干胶可吸附2.5ｇ水。
一般将SephadexＧ-10至Ｇ-50的凝胶称为硬胶，因其吸水量比较小；而SephadexＧ-75、Ｇ-200由于吸水量大，膨胀度较大，称之为软胶。
层析时选用何种凝胶，需根据被分离物质分子的大小及分离目的不同而决定。一般把用于小分子物质如无机盐从有机大分子中分离出来的层析，多使用“筛眼”小的凝胶如SephadexＧ-10至Ｇ-50；分离分子大于10 000以上的两种分子大小近似的物质时，使用“筛眼”大的Ｇ-75以上的凝胶。
凝胶基本上是一种不带电荷的球状物质。本身不会与被分离的物质相互作用，所以分离效果好。但葡聚糖凝胶分子上含有的羟基，能与某些蛋白质的碱性基团相互作用，吸附少量蛋白质。为此，在洗脱时可在洗脱液中加入
氯化钠等中性盐，提高离子强度，当离子强度大于0.05时即可克服这种吸附。
２．聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺和N，N′-次甲基二丙烯酰胺聚合而成。其商品名为生物胶Ｐ（Bio-GelP)。其孔穴大小也是随交联增多而减少，并用Ｐ值表示不同的交联度。Ｐ值越大，孔径也越大。
３．琼脂糖凝胶
琼脂糖是从
海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性组分。它是Ｄ-半乳糖和3，6-
脱水Ｌ-半乳糖相间重复结合而成的链状化合物。
这种糖链依靠糖基之间的氢键作用，形成稳定的网状结构，网状结构的疏密依靠改变琼脂糖浓度的方法来控制，因此商品也是以含水状态供应。因为琼脂糖凝胶靠的是氢键相交联，一般型号只能在0～40℃以及Ph4～9范围内使用。近年，应用交联剂制备得到的cl型和FF型琼脂糖则有比较好的稳定性，能用于浓脲、胍、有机溶剂及非离子型去污剂溶液，还能经受110～120℃高压灭菌处理，对生物大分子的吸附能力也特别低。无论是哪种琼脂糖凝胶，其机械强度都比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶好得多，同时它对生物大分子等高分子的吸附作用也小得多。另外，琼脂糖凝胶适用相对分子质量的范围宽，最大可以到108，这一点是另外两种凝胶所无法达到的。正由于以上这些优点，它的应用受到人们的重视。琼脂糖的商品名为Sepharose或Bio-GelA。
(三)操作方法
１、凝胶的处理 为了获得合适的流速和良好的分离，凝胶粒子在使用前需经一定处理，主要是将凝胶的保存液更换到分离蛋白质的洗脱液中，对于Sephadex系列凝胶在使用前需充分的膨胀与浮选。
２、装柱 取适当长度的色谱柱（Ｇ-200选用2.5cm×100cm)，底部铺上尼龙筛网或玻璃丝，以不漏粒子为准。用缓冲液（如PBS)饱和凝胶粒子，置室温1h后上柱。自顶端倾注凝胶悬浮液时，应沿直插到
管底的玻璃棒缓缓流入，以免产生气泡与漏出粒子。为了防止分层，最好将凝胶悬液放于贮液瓶中，连续加入。
３、柱填充的检查和Vo的测定 检查柱子填充是否正确的最好方法是用此柱分离某些有色物质。蓝色葡聚糖-2 000是常用的一种物质，它是一种高分子葡聚糖，含有蓝色发色基团，因此可在一次操作中检查柱子的填充状况和测定出滞留容量Vo。方法是把0.2%的蓝色葡聚糖-2 000溶液（1/50～1/100柱床体积)加到柱子上，洗脱液的离子强度应为0.02或更高。在色谱分离过程中，可能出现的色带形状。柱子填充良好是获得好的分离结果所必需的。如果用蓝色葡聚糖进行实验后获得了一个不好的色谱带，那么就说明凝胶床没有填好。在这种情况下，柱子必须重新装填。
４、加样 在加样时，为了不扰乱凝胶表面，可在顶部放上一层圆形滤纸或尼龙网，也可覆盖一层SephadexG-25（5mm厚)的凝胶。样品要有一定的浓度和体积。通常为床柱体积的1%～10%，浓度不宜超过1%～4%。
５、洗脱 洗脱剂多采用低离子强度的盐溶液。
www.med126.com各种类型凝胶对流速要求不一。
６、再生 样品洗脱完毕后，凝胶柱即已再生。一次装柱，可反复使用多次。因此操作简便，重复性高。
７、保存 各型凝胶悬液加防腐剂或灭菌后，可置冰箱保存数月。防腐剂类型很多，最常用的有0.02%的叠氮化钠与0.05%的柳硫汞等，也可用高压蒸汽0.1MPa 30min灭菌。
(四)应用
凝胶层析是一种快速、简便的分离分析技术。由于设备简单，操作方便，不需有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸、多糖、激素、抗生的素、生物碱等物质的分离和提纯，也可用于蛋白质溶液的脱盐及高分子溶液的浓缩、蛋白质相对分子质量的测定等。
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