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公开(公告)号
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CN101037477A
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公开(公告)日
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2007.09.19
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申请(专利)号
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CN200710020034.7
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申请日期
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2007.02.08
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专利名称
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人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品
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主分类号
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C07K19/00(2006.01)I
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分类号
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C07K19/00(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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江南大学
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发明(设计)人
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金 坚;张莲芬;徐 钰;许正宏;雷楗勇;窦文芳;史仲平
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地址
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214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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无锡市大为专利商标事务所
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代理人
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时旭丹;刘品超
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国省代码
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江苏;32
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主权项
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人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法，其特征是从新鲜人外周血中分离单核淋巴细胞，刺激培养，提取RNA，通过RT-PCR反转录得到G-CSFcDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA；利用重叠PCR技术，连接HSAcDNA和G-CSFcDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-GCSFcDNA融合基因插入到克隆载体，HSA-GCSFcDNA融合基因在宿主系统进行表达，HSA-GCSFcDNA融合基因被整合到宿主的染色体中； (1)G-CSFcDNA的克隆： 以反转录PCR得到的G-CSFcDNA第一链为模板，通过PCR扩增出G-CSFcDNA，所用的引物如下： p1：5’-CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’ p2：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，G-CSFcDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环35次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-GCSF，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-GCSF； (2)HSAcDNA的克隆： 利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSAcDNA，所用的引物为： PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA； (3)HSAcDNA和G-CSFcDNA融合基因的克隆： HSAcDNA的PCR扩增，所用引物如下： P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P2：5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次； G-CSFcDNA的PCR扩增，所用引物如下： P3：5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’ P4：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-GCSF1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次； 利用重叠PCR融合G-CSFcDNA和HSAcDNA： 将G-CSF的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以4∶6比例混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，60.5℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带
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摘要
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人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将HSA基因cDNA和G-CSF cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-GCSF cDNA融合基因在宿主系统中进行表达，融合基因被整合到宿主的染色体中；本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人粒细胞集落刺激因子的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
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国际公布
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