| 公开(公告)号 | CN100338090C |
| 公开(公告)日 | 2007.09.19 |
| 申请(专利)号 | CN02155189.8 |
| 申请日期 | 2002.12.17 |
| 专利名称 | 生长抑素全合成新方法 |
| 主分类号 | C07K7/64(2006.01)I |
| 分类号 | C07K7/64(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 常州市第四制药厂有限公司 |
| 发明(设计)人 | 严益民;屠永锐;孙永强;马亚平;邓金根 |
| 地址 | 213004江苏省常州市南郊梅龙坝 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 上海新天专利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 国省代码 | 江苏;32 |
| 主权项 | 一种生长抑素全合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤：I.程序反应生长抑素线肽合成采用程序反应，步骤如下：以Fmoc-Cys(Trt)-2-氯三苯甲基树脂(Fmoc-Cys(Trt)-resin)为起始固相合成载体，每次通过程序反应：第一次与Fmoc-Ser(tBu)-OH反应得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第二次与Fmoc-Thr(tBu)-OH反应得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第三次与Fmoc-Phe-OH反应得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第四次与Fmoc-Thr(tBu)-OH反应得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第五次与Fmoc-Lys(Boc)-OH反应得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第六次与Fmoc-Trp-OH反应得Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第七次与Fmoc-Phe-OH反应得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第八次与Fmoc-Phe-OH反应得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin第九次与Fmoc-Asn(Trt)-OH反应得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；第十次与Fmoc-Lys(Boc)-OH反应得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-rein；第十一次与Fmoc-Cys(Trt)-OH反应得Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-rein；第十二次与Boc-Ala-Gly-OH反应得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-rein；程序反应用下列步骤洗涤：(1)用二氯甲烷5-7ml/g洗2次，每次2分钟；(2)用甲醇5-7ml/g洗2次，每次2分钟；(3)用20％哌啶/DMF10ml/g洗2次，每次20分钟；(4)用二氯甲烷5-7ml/g洗3次，每次2分钟；(5)用甲醇5-7ml/g洗3次，每次2分钟；(6)加入1-3当量Fmoc保护氨基酸，1-3当量HOBt，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N，-二甲基甲酰胺溶解，而后加入1-3当量1mol/lN，N，-二环己基碳酰亚胺/二氯甲烷，机械搅拌，4小时；(7)用二氯甲烷5-7ml/g洗3次，每次2分钟；(8)用甲醇5-7ml/g洗3次，每次2分钟；II.切割反应步骤I程序反应得到的合成生长抑素树脂线肽采用K试剂切割：将K试剂加入到10ml-30ml/g树脂中，树脂立即变为紫红色，冰水浴下机械搅拌反应5小时后，过滤，并用K试剂洗涤树脂，加入过量冷乙醚，即析出白色固体，过滤，收集白色固体，余渣用10％醋酸洗涤后，合并，冷冻干燥得线肽；所述K试剂由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水组成，它们的体积比为33∶2∶2∶2∶1；III.氧化环合与纯化工艺对得到的线肽按照1mg/1.5ml的浓度进行室温氧化环合，氧化溶剂为0.01-1％双氧水或0.1-5％二甲亚砜水溶液；大于或等于5小时后，氧化环合完全；直接上C18填料的中压色谱柱，所述中压色谱柱为5-500mg/g填料；先用蒸馏水将双氧水或二甲亚砜从色谱柱上洗脱，然后，用0-80％MeOH/H2O以及0.1-10％AcOH将产品从色谱柱梯度洗脱，浓缩后，冷冻干燥，一次性可得到除去双氧水或二甲亚砜的产品，最后通过柱层析纯化，用0.2％AcOH/MeOH和0.2％AcOH/H2O洗脱，进行二次纯化，冷冻干燥得纯化产品；IV.交换反应制备醋酸生长抑素(1)将步骤III得到的生长抑素三氟醋酸盐溶于10％醋酸中；(2)将此溶液加入到强碱性离子交换树脂柱上；(3)用10％醋酸水溶液洗脱样品；收集洗脱液；用茚三酮显色反应进行跟踪；合并洗脱液浓缩、冷冻干燥得醋酸生长抑素白色固体。 |
| 摘要 | 本发明属生物技术领域，本发明公开了生长抑素(14肽)的固相合成新方法。本方法采用2-氯三苯甲基树脂作固相载体，在该树脂首先连接保护半胱氨酰基(Fmoc-Cys(Trt)-)，采用Fmoc保护氨基酸的程序接肽法完成生长抑素线肽的合成，用三氟醋酸一次脱除线肽侧链保护基团，并切割树脂，得到生长抑素线肽的三氟醋酸。该中间产物在双氧水或二甲基亚砜水溶液中氧化环合，得到生长抑素三氟醋酸盐粗制品。该粗制品经C18键合硅胶中压柱，用甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得生长抑素三氟醋酸精制产品。该产品用醋酸离子交换树指交换，并冷冻干燥得最终产品。本方法制备生长抑素具有产率高，合成快，不易消旋，可分子内选择性氧化环合，纯度好，方法简便等优点。可用于大批量生产制备。 |
| 国际公布 |
