| 公开(公告)号 | CN1940074A |
| 公开(公告)日 | 2007.04.04 |
| 申请(专利)号 | CN200610069659.8 |
| 申请日期 | 2006.08.07 |
| 专利名称 | 胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途 |
| 主分类号 | C12N15/63(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/63(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I;C07H21/02(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 汪运山 |
| 发明(设计)人 | 汪运山;胡安拉;马晓丽;朱之炜;肖东杰;孙善会;郏雁飞;周 芳 |
| 地址 | 250013山东省济南市历下区解放路105号中心医院 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 济南金迪知识产权代理有限公司 |
| 代理人 | 王绪银 |
| 国省代码 | 山东;37 |
| 主权项 | 靶向AFP基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector为载体，针对甲胎蛋白(AFP)基因编码区上、中、下游的三段序列，在可特异表达AFP的人胃腺癌细胞株FU97中发挥RNA干扰作用，这三段AFP特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于与AFP相关的胃癌的治疗性物质，由以下方法制得： (1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成 选择AFP基因编码区的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下： ①AFP寡核苷酸序列1： 正义链5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’ 反义链5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’ ②AFP寡核苷酸序列2： 正义链5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’ 反义链5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’ ③AFP寡核苷酸序列3： 正义链5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’ 反义链5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’ (2)将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector连接、转化、扩增及质粒的提取 首先用TE缓冲液重悬AFP寡核苷酸1/2/3干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分钟，37℃2分钟，25℃2分钟完成退火；然后将退火后的双链寡核苷酸与pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选，将单克隆阳性重组子小量扩增，再用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA； (3)质粒的鉴定 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector质粒中。 |
| 摘要 | 一种胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对AFP基因的不同靶序列，构建了三个能在哺乳动物细胞中表达shRNA的表达质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNAl、pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA2和pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA3，能高效的特异性的抑制AFP基因表达，可用于制备治疗分泌AFP的胃癌的基因药物。 |
| 国际公布 |
