体外培育牛黄—胆红素的测定—紫外可见分光光度法

本方法采用紫外可见分光光度法测定体外培育牛黄中胆红素的含量。

本方法适用于牛科动物牛Bos Taurus domesticus Gmelin的新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成的体外培育牛黄的测定

供试品经三氯甲烷-乙醇（7：3)的混合溶液加热回流，提取液加入乙醇和重氮化溶液，暗处放置后，置于分光光度计，于波长533nm处测定吸收度，按胆红素计算其含量。

1. 三氯甲烷-乙醇（7：3)的混合溶液

2 .乙醇

3 .重氮化溶液

4 .盐酸

1. 紫外-可见分光光度计

2. 分液漏斗

1. 对照品溶液的制备

去胆红素对照品10mg，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含胆红素10μg的溶液。

2. 供试品溶液的制备

取本品细粉10mg，精密称定，置锥形瓶中，加三氯甲烷-乙醇（7：3)的混合溶液60 mL、盐酸1滴，摇匀，置水浴上加热回流30分钟，放冷，移至100 mL棕色量瓶中。容器用少量混合溶液洗涤，洗液并入同一量瓶中，加上述混合溶液至刻度，摇匀。精密量取3 mL，置具塞试管中，加乙醇至9 mL，精密加入重氮化溶液（甲液：取对氨基苯磺酸0.1g，加盐酸1.5 mL与水适量使成100 mL。乙液：取亚硝酸钠0.5g，用水溶解并稀释至100 mL，置冰箱内保存。临用时取甲液10 mL与乙液0.3 mL，混匀)1 mL，摇匀，在15~20℃的暗处放置1小时，作为供试品溶液。

1. 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液1mL、2mL、3mL、4 mL、5 mL，分别置具塞试管中，加乙醇至9 mL，各精密加入重氮化溶液（甲液：取对氨基苯磺酸0.1g，加盐酸1.5 mL与水适量使成100 mL。乙液：取亚硝酸钠0.5g，用水溶解并稀释至100 mL，置冰箱内保存。临用时取甲液10 mL与乙液0.3 mL，混匀)1 mL，摇匀，在15~20℃的暗处放置1小时，以相应的试剂为空白，在533nm波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2. 供试品的测定

精密量取上述供试品溶液3mL，置具塞试管中，照标准曲线的制定项下的方法，自“加乙醇至9 mL”起，依法测定吸收度。

注：分光光度法应以配制供试品的同批溶剂为对照，采用1cm的石英吸收池。以吸收度最大的波长作为测定波长，一般供试品的吸收度读数，以在０.３－０.７之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸收度偏低。狭缝宽度的选择，应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。