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1.2.5 YARAEGFP融合蛋白的定量：用Bradford法[10]对纯化蛋白进行定量，以标准牛血清蛋白作为标准对照。取考马斯亮蓝G250染液2 mL装入石英管中，在595 nm处用紫外分光光度计调零，然后加入10 μL标准牛血清蛋白(1 mg/mL)，再取一只石英管加入2 mL考马斯亮蓝G250染液和透析后的YARAEGFP蛋白10 μL，混匀，分别用紫外分光光度计在595 nm下测定两种蛋白的吸光值。融合蛋白YARAEGFP浓度(mg/mL)=(测定样品在595 nm处的OD值/标准牛血清蛋白在595 nm处的OD值)×1 mg/mL。
2 结果
2.1 pET15bYARAEGFP重组质粒的构建
构建的pET15bYARAEGFP经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，阳性克隆含有长度约137 bp和6 428 bp的两条带(图2)，说明YARA编码序列成功地插入到酶切大片段的XhoⅠ和NdeⅠ位点。
2.2 pET15bYARAEGFP重组质粒的测序
重组质粒pET15bYARAEGFP的测序结果显示编码YARA的DNA序列成功插入到酶切后的质粒中，编码YARA的DNA序列与人工合成的YARA编码序列完全一致(图3)。
2.3 YARAEGFP融合蛋白的定量
经Bradford法测定，纯化后的YARAEGFP蛋白浓度为1.098 mg/mL。
2.4 YARAEGFP融合蛋白的定性
考马斯亮蓝凝胶染色和Western blot结果显示YARAEGFP融合蛋白分子量约为29 kD(图4)，与预期的分子量相符。
3 讨论
细胞穿透肽(Cell penetrating peptides，CPPs)是一些通过非能量、非胞吞途径把蛋白质、肽段和DNA等大分子物质跨膜转导入细胞内的小于30个氨基酸的肽段[1]，CPPs能携带靶蛋白进入细胞内发挥生物效应。CPPs具有转运效率高、毒性低、体内外均可应用、对运载物质的大小无明显限制、无免疫原性，不引起炎症反应、且对进入细胞的物质的量可有效控制并使其保持在生理浓度范围等优点，而在物质运输领域得到广泛的应用。目前发现的CPPs主要有HIV1 反式激活因子的TAT、单纯疱疹病毒VP22、果蝇触角足蛋白同源结构域Antp以及人工设计的CPPs，如PEP1和YARA等。但TAT介导的蛋白转导需要融合蛋白在导入前进行变性，才能使融合蛋白进入细胞内。变性的TAT融合蛋白进入细胞内后，需HSP90家族成员将靶蛋白重折叠为天然有活性的构象，因此导入蛋白的生物活性依赖于HSP90分子伴侣的重折叠效率[11]。为了提高转导的蛋白进入细胞后的生物活性，需要设计一种新的转导肽将靶蛋白以一种天然有活性的结构形式转导入细胞内。Morris小组[12]设计合成了一个21个氨基酸的肽段载体PEP1，研究表明PEP1能把GFP、SOD、βGal、右旋糖苷、各种抗体等大分子物质转导进入多种哺乳动物细胞内[12-15]。董晓等[16-18]发现PEP1能有效携带目的蛋白EGFP穿透进入人血管平滑肌细胞、小鼠皮肤并分布于表皮和真皮，在体研究发现PEP1能介导EGFP转导入心、脑、肝、脾、肾组织内。医.学.全.在.线www.med126.com
TAT有一个强的α螺旋结构，其有一面富含精氨酸残基，为进一步提高CPPs的转导效率，Ho等[9]在α螺旋的一面优化精氨酸残基的位置和用丙氨酸残基来替代部分氨基酸序列(丙氨酸具有最大的α螺旋稳定值)，以得到更加稳定的α螺旋结构的CPPs，即YARA，其序列为：YARAAARQARA。YARA在二级结构上是双亲结构，亲水部分可能有利于精氨酸上带正电的胍基与细胞表面结合，而疏水部分可能更加有利于穿透细胞膜。实验证明YARA能介导大分子物质转导入离体和在体的细胞内并且其转导能力较TAT有明显增强，其转导效率是TAT的33倍。
