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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂:限制性核酸内切酶XhoⅠ、NdeⅠ、XbaⅠ和T DNA连接酶购自北京赛百盛基因技术有限公司;编码YARA的两条寡核苷酸链由北京赛百盛基因技术有限公司合成，序列为正义链：5′TATGTATGCCCGCGCGGCGGCGCGACAAGCGCGAG CCC3′(38 bp)，反义链：5′TCGAGGGCTCGCGCTTGTCGCGCCGCCGCGCGGGCATACA3′(40 bp)，100 bp DNA Ladder购自北京华美生物工程有限公司;IPTG(isopropyl βDthiogalactoside)购自美国Promega公司;Ni2+NTA 树脂填料购自美国QIAGEN公司;预染蛋白质相对分子量标准购自江苏碧云天有限公司;兔抗Histag多克隆抗体购自Santa Cruz公司;Western blot试剂盒购自美国KPL公司;ECL化学发光试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech公司。
1.1.2 质粒与菌株:pET15b,E.coli BL21(DE3)购自美国Novagen公司，E.coli DH5α和pET15bPEP1EGFP原核表达载体由郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所提供。
1.1.3 主要仪器:投射式紫外分析仪(EF90A，上海)，凝胶成像系统(Touching 955 gel document system，上海)，台式高速冷冻离心机(Hettich，Universal 32 R，德国)，超声波细胞粉碎仪(JY983D，宁波)，超速冷冻离心机(Hitachi，Himac CP80MX，日本)，核酸蛋白检测仪(HD2004B，上海)，恒流泵(HL2，上海)，紫外分光光度计(Cecil 2041，英国)医.学.全.在.线www.med126.com。
1.2 方法
1.2.1 pET15bYARAEGFP的构建:将pET15bPEP1EGFP分别用XhoⅠ、NdeⅠ酶切，使之去掉编码PEP1的DNA序列，酶切产物用1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外灯下切取含酶切大片段的凝胶，65 ℃水浴10 min融化凝胶，用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀用10 μL消毒三蒸水溶解。将编码YARA的两条寡核苷酸链等摩尔混合后煮沸变性，再逐渐降温至室温复性，形成两端分别为XhoⅠ和NdeⅠ粘性末端的双链DNA，然后与线性化的酶切大片段用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌，扩增后提取重组质粒并用XhoⅠ和XbaⅠ酶切鉴定，若出现137 bp片段，说明编码YARA的DNA片段插入到酶切后的质粒中，成功插入了编码YARA序列的质粒命名为pET15bYARAEGFP(图1)。将重组正确的质粒送北京华大中生科技有限公司进行DNA测序。
1.2.2 pET15bYARAEGFP转化E.coli BL21(DE3)和YARAEGFP融合蛋白的诱导表达:从-80 ℃超低温冰箱取出100 μL E.coli BL21(DE3)，取1 μL pET15bYARAEGFP质粒加入菌液中，轻弹管壁，使其均匀分布，置冰上30 min，42 ℃水浴中热休克90 s后，迅速置冰浴冷却2 min。取1 mL SOC培养基与转化菌液混匀后加入10 mL离心管，将其置37 ℃水浴摇床中振摇(150 r/min)1 h。转化的菌液铺于含100 μg/mL Ampicillin的LB平板上，置37 ℃细菌培养箱中过夜，挑取单克隆接种于5 mL LB液体培养基中，37 ℃振摇培养过夜，然后用新鲜培养基按1∶50比例稀释，扩大培养至OD600≈0.8时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，30 ℃培养12 h以诱导目的蛋白的表达。4 ℃、5 000 r/min离心5 min，收集细菌沉淀，1×PBS漂洗3次，加6倍柱体积的结合缓冲液(5 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)重悬菌体。然后冰浴超声破菌(520 W，30 min)，将菌液置超速冷冻离心机中20 000 r/min离心10 min，则融合蛋白以天然、可溶的形式存在于上清中。
1.2.3 YARAEGFP融合蛋白的纯化:pET15b作为载体所表达的基因工程重组蛋白在其N端带有一个由6个组氨酸组成的“标签”(Histag)，可用Ni2+NTA树脂进行亲和层析纯化。收集超离后的上清，将其转入装有Ni2+NTA树脂的层析柱中，静置4 h，以便6个组氨酸标签与填料中Ni2+充分结合。用10倍柱体积的漂洗缓冲液(30 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)过柱以洗去未结合的杂蛋白，然后用5倍柱体积的洗脱缓冲液(500 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)洗柱并收集洗脱下来的目的蛋白YARAEGFP。目的蛋白用生物半透膜透析48 h以充分脱盐(透析液为 pH 7.4的 PBS)，透析后的融合蛋白用0.45 μm的滤膜除菌后，用1.5 mL Eppendorf 管分装，-20 ℃保存备用。
1.2.4 YARAEGFP融合蛋白的定性：制备12%分离胶和5%浓缩胶，分别取含有目的蛋白的细菌裂解上清(纯化前)和收集的峰值洗脱液(纯化后)行SDSPAGE 电泳，凝胶用考马斯亮蓝R250 染色40 min后，用SDSPAGE凝胶脱色液放在水平摇床上振摇脱色至本底无色为止。融合蛋白经SDSPAGE分离后行Western blot以进一步证实纯化产物。将凝胶电转印至硝酸纤维素膜上，加10 mL封闭液封闭2 h阻断非特异性结合部位，加入1∶1 000稀释的一抗(兔抗组氨酸多克隆抗体)10 μL， 室温振摇孵育过夜。Western blot漂洗液漂洗4次，每次8 min。加10 mL封闭液及按1∶1 000 稀释的羊抗兔二抗10 μL，水平摇床孵育2 h 后漂洗4次，每次8 min。用三蒸水冲洗一遍硝酸纤维素膜，放入干净的平皿中加入1 mL化学发光剂ECL，置入暗室用X光胶片曝光，然后显影，定影。医.学.全.在.线www.med126.com
