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3 讨 论
关节软骨没有血液供应和神经支配，损伤后自身修复能力有限，许多学者尝试用组织工程化软骨来修复关节缺损，获得了较为满意的效果，修复组织主要为透明样软骨。但是新生软骨的功能差于正常关节软骨，这可能是由于新生软骨组织尚未达到正常关节软骨基质的组织结构和生物化学性能，而软骨基质是软骨特有生理功能的基础，所以临床上要想重建关节软骨，恢复关节的功能，修复软骨组织基质分子代谢的机制研究就显得很重要。本实验应用4种单克隆抗体3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13，初步探讨组织工程修复软骨基质中蛋白聚糖的代谢及两种相关调节酶MMPs和aggrecanases的作用。
蛋白聚糖是软骨基质的主要成分之一，填塞于Ⅱ型胶原所构成的网状结构中，单体由一条核心蛋白与一至上百条氨基聚糖链组成。蛋白聚糖含有许多酸性基团，能吸纳大量的水分，从而保证关节软骨良好的黏弹性，完成抵抗压力的功能医.学.全.在.线www.med126.com。
3-B-3(-)是指在利用3-B-3作为一抗孵育前，不用硫酸软骨素ABC酶对样本进行预处理。3-B-3(-)识别的位点是一个由饱和的己糖醛酸和一个N-乙酰半乳糖胺构成的二糖单位，该位点位于完整的CS链末端，在有3-B-3(-)表达的地方，说明此处存在有新合成的蛋白聚糖。利用3-B-3(-)进行的一系列研究发现：其主要表达于未成熟和处于生长、重构期的关节软骨组织，正常成年关节软骨肥大细胞区[5]。3-B-3(-)的表达常被视为蛋白聚糖合成的标志，在修复软骨组织中，新合成蛋白聚糖意味着软骨细胞试图修复、重塑软骨组织。本研究中修复组织3-B-3(-)表达位于修复组织中下层，显示修复组织合成新的蛋白聚糖。
MMPs和aggrecanases是调控软骨细胞外基质蛋白聚糖代谢最主要的两种酶。MMPs降解蛋白聚糖时最重要的裂解位点位于核心蛋白(interglobulin domain, IGD)Asn341～Phe342之间，酶切这一肽键可以产生C-末端序列为VDIPEN的新表位，是 BC-4特异性的识别位点;aggrecanases降解蛋白聚糖时最重要的裂解位点位于IGD区Glu373～Ala374之间，酶切这一肽键可以产生C-末端序列为NITEGE的新表位，可以被BC-13特异性识别[12]。研究显示在人的软骨组织代谢中，MMPs和aggrecanases两种酶在正常关节软骨基质蛋白聚糖的基础代谢、软骨损伤蛋白聚糖的降解以及修复软骨组织重塑中都具有重要作用[13-14]。但在动物体内外实验研究显示，MMPs和aggrecanases在基质蛋白聚糖代谢中的作用不同。
体外培养兔[15]、猪[16]的软骨组织发现，aggrecanases降解片段表达阴性，而MMPs降解片段表达阳性，当用炎性因子IL-1刺激后，aggrecanases活性明显增强，降解片断增加，而MMPs活性表达不变，或改变不明显。鼠关节炎关节软骨中aggrecanases的降解片段表达明显增加，而敲除aggrecanases基因，可以明显减轻或阻止鼠关节炎的发生[17-19]。以上结果显示MMPs 在基质蛋白聚糖的基础代谢中起重要作用，而aggrecanases的主要作用是在软骨受到损伤时降解蛋白聚糖。本实验中，MMPs及其降解片段BC-4在体内修复组织和正常软骨组织表达阳性，而aggrecanases的降解片段BC-13表达阴性，显示MMPs在兔软骨基质蛋白聚糖基础代谢以及修复重塑中起重要作用，与文献报道一致，而aggrecanases主要作用是在软骨受到损伤时降解蛋白聚糖[15，20]。
关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，软骨细胞合成并分泌蛋白聚糖和胶原在内的多种基质成分，同时也合成多种降解基质的酶。生理情况下，成熟软骨组织细胞外基质的合成和分解之间相互制约，相互作用，维持着代谢的动态平衡，从而保证软骨组织结构和功能的完整性[2，21]。在骨关节炎(osteoarthritis, OA)及急性关节损伤等病理状态下，这种动态平衡被打破，各种损伤因素可以引起肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白细胞介素1(interleukin-1, IL-1)升高，组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMP)和ɑ-2巨球蛋白(ɑ-2 macroglobulin, ɑ2M)表达下降，MMPs和aggrecanases表达增加，活性增强，细胞外基质蛋白聚糖和胶原分解大于合成，关节软骨受损，功能减弱[22-23]。
在关节软骨损伤过程中蛋白聚糖与胶原的代谢变化以及和相关调节分子之间的关系已有了一定的了解，而在修复过程中这些分子的表达状况及其关系研究的很少。FRISBIE[24]和BARNEWITZ[25]用构建的组织工程软骨移植修复关节骨软骨缺损，在缺损处形成透明样软骨，但是修复组织质量差于正常关节软骨。软骨组织代谢比较慢，修复的软骨组织是否会随着时间的推移发生重塑，接近或达到正常关节软骨的生物性能?要回答上面的问题，软骨修复过程中基质分子代谢机制的研究就很重要。JAMES等[26]体外构建的组织工程软骨，在生理机械力作用下IL-1、MMP-1、aggrecanases等表达下降，转化生长因子-β表达上升，胶原和糖氨聚糖合成增加。根据相关研究[26-27]推测，在软骨修复过程中，参与细胞外基质合成代谢的大分子(TIMP、ɑ2M等)表达增多、活性增强，而参与分解代谢的大分子(MMPs、aggrecanases等)则相对表达降低、活性减弱，胶原和蛋白聚糖合成大于分解，才能修复软骨缺损。在本研究中，软骨修复组织蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加，而MMPs及其降解表位BC-4表达降低，修复组织合成代谢大于分解代谢，修复损伤的软骨组织，这与生长期软骨组织的合成代谢大于分解代谢相似[2]。软骨组织代谢比较慢，随着时间的推移修复软骨组织的合成与分解代谢是否会达到平衡，是否会成功重塑、再生损伤的软骨，使其接近或达到正常关节软骨还需要做进一步的长期研究。
