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1.3.2 入门克隆与表达载体pAd/CMV/DEST-V5同源重组创建表达克隆 根据入门克隆的浓度进行LR重组反应:入门克隆3 μL。表达载体pAd/CMV/DEST-V5 1 μL。TE缓冲液4 μL。LR ClonaseTM 酶2 μL。以上反应体系轻轻混合后置于25 ℃水浴箱过夜,取2 μL反应产物转化TOP10感受态大肠杆菌,最后凃板于含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养板,置于37 ℃培养箱中16 ~ 24 h观察阳性克隆,并挑取单个克隆摇菌,提取质粒,电泳鉴定以及利用目的基因引物进行最后测序。
1.4 重组腺病毒载体在293A细胞中的包装与扩增
取重组腺病毒质粒约5 μg,用PacⅠ内切酶酶切使之线性化,同时切去质粒的Amp+和Ori位点,暴露病毒的ITRs位点,用7 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。用乙醇沉淀法纯化酶切产物,测D值确定浓度,按照lipofectmin操作程序对90%生长融合的低代293A细胞转染,按lipofectmin(。滋L)/DNA(。滋g)约1:1的比例以及每孔1 ~ 5 。滋L的lipofectmin剃度进行转染,转染8 h后弃转染液,加入新鲜培养液1 mL/孔,在观察出现CPE之前3日换液一次,出现CPE后停止换液。待293A细胞出现100%CPE时利用 -80 ℃,30 ℃各15 min反复冻融3次,吹打离心得到病毒上清。利用第一代病毒上清液250 μL再次感染75 cm2培养瓶中的293A细胞以提高病毒滴度。同时提取病毒DNA进行PCR鉴定: 用TAKARA MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit 提取病毒DNA,利用目的基因引物进行PCR 鉴定,确认目的基因包含在病毒载体中。
TCID50病毒滴度测定:在96孔板中分8个病毒稀释梯度,每个梯度12孔(一排),其中前2孔为阴性对照,实际每个梯度10孔,加入到20 mL/L胎牛血清培养液(DMEM)的293A细胞中,37 ℃培养箱培养10 d。10 d后倒置显微镜下观察,计算每一排中出现CPE的孔数,根据T = 101+d(S-0.5),最后将TCID50/mL转换为PFU/mL。
1.5 大鼠MSC的分离,培养与鉴定
取4周龄SD雄性大鼠一只,断颈处死,750 mL/L酒精浸泡10 min,无菌下取双后肢股骨和胫骨,将其附着肌肉和结缔组织分离干净,PBS冲洗,用无菌剪从中间剪短股骨及胫骨,用5 mL注射器注入PBS在断端冲洗骨髓直到骨质变白,冲洗液用2支15 mL离心管收集,250 × g,离心10 min,吸弃滤液,沉淀细胞中加入100 g/L高糖DMEM 10 mL。用吸管吹打至单个悬细胞,接种于2个25 cm2培养瓶中,37 ℃。体积分数为5%CO2饱和湿度的培养箱中培养;3 d后半量换液,6 d后全量换液,10 d后细胞80%汇合,用2.5 mL/L胰蛋白酶消化传代,继续培养。
第3代MSC利用流式细胞仪分别对CD29。CD44。CD105阳性,CD45阴性进行检测鉴定;利用第3代MSC进行成脂诱导(含1 μmoL/L地塞米松, Insulin 10 mg/L, IBMX 0.5 mmol/L, Indomethacin 0.2 mmol/L的100 g/L高糖DMEM),成骨诱导(含0.25 mmol/L抗坏血酸。10 mmol/L β-磷酸甘油与10 nmol/L地塞米松的100 g/L高糖DMEM),4周后分别进行油红O,茜素红染色进行鉴定。
1.6 试验分组
分别根据转染时不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI)将试验组分为A。B。C。D 4组(A组MOI = 0.1;B组MOI = 1;C组MOI = 10;D组MOI = 100);对照组:利用Ad-LacZ转染(MOI = 10)作为阳性对照E组,未加病毒转染(MOI = 0)作为阴性对照F组;每一个实验组用12孔(两个6孔板)进行试验观察。
1.7 转染过程
将第3代MSC传代与12个6孔板中(5 × 104 cells/孔),标记各板,24 h完全贴壁后各板各孔按原计划计算加入病毒液量,轻轻平摇1 min, 使病毒液与培养基均匀混合,放回培养箱继续培养,12 h后弃培养基,换新鲜培养基。3 d后换液,每孔加入新鲜培养基1 mL,7 d后换液,同时保留培养液用于检测。10 d后再次换液,14 d后再次换液,保留培养液用于检测。
1.8 培养液碱性磷酸酶活性。骨钙素含量的检测
操作方法按试剂盒説明书,同时利用考马斯兰法测定培养液培养液中蛋白的含量,将碱性磷酸酶活性换算成u/mg。
1.9 免疫组化检测Ⅰ型胶原蛋白,骨钙素,以及骨钙结节的检测
利用盖玻片置于六孔板中便于细胞爬片,转染2周后取出玻片,按免疫组化试剂盒説明书进行相关步骤操作。3周后进行茜素红染色,观察骨钙结节形成情况。
1.10 Western-blot检测LMP-1基因在MSC中的表达情况
转染48 h后利用细胞裂解液冰上裂解细胞,收集蛋白进行SDS-PAGE电泳;经过转膜,一抗二抗孵育以及显色反应,摄片观察保存。
1.11 统计学处理
试验数据采用x ± s表示,利用SAS8.1统计学软件进行统计处理,组间差异利用方差分析,组间两两比较采用SNK统计。
2 结 果
