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人喉癌细胞COX-2基因真核表达载体医学论文
1. 引言
Cyclooxygenase-2 （环氧化酶－2, COX-2) 是近几年来引人注目、在多种恶性肿瘤当中有高表达的基因， 这些肿瘤包括结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌和肝癌等。
COX-2 与肿瘤细胞的血管新生、凋亡、细胞循环周期、脂质代谢均有着重要的关系， 是众多非甾体类药物（Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) 如阿司匹林、布洛芬、吡洛西康等药物的靶蛋白。环氧化酶（Cyclooxygenases,COXs) 是催化花生四烯酸（Arachidonic acid,AA) 转化为前列腺素（Prosglandins, PG)的限速酶， 两种COX 同功酶已经被分离和界定：COX-1 和COX-2。它们有不同的编码， 是有各自的特性的不同的基因。COX-1 在大多数哺乳动物的细胞中有基本的表达，而COX-2 主要是在炎症状态下和以下情形下被诱导表达而行使生物功能， 如生长因子、有丝分裂、各种细胞素等。COXs 蛋白可以将花生四烯酸催化成各种PG 产物， PG 有各种亚型， 而其中PGE2 尤为重要。COX-2 是一个和多个肿瘤因子发生密切相联系的蛋白质。有越来越多的研究已经证实COX2 蛋白在多方面参与肿瘤的形成过程， 文献报道头颈肿瘤能够部检出COX-2 的异常表达。鼻咽癌是我国部分地区发病率较高的头颈肿瘤之一， 有学者研究发现COX-2 在鼻咽癌发生、发展中也起着重要的作用；头颈部肿瘤COX-2 的mRNA 水平是健康人正常口腔黏膜的150 倍。另有报道鳞状细胞癌 （Squamous cell carcinoma, SCC) 包括咽鳞状细胞癌中和喉鳞状细胞癌中COX-2 都有过高的表达。喉鳞状细胞癌 （laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC) 的高分化癌中COX-2 有较强的表达。可以预示喉鳞状细胞癌有不佳预后， 并警示的内皮生长因子Epidermal growth factor receptor, EGFR)能刺激COX-2 的表达。国外有学者报道：COX-2 可以作为LSCC 的一个治疗攻击靶向。国内的研究学者也报道：COX-2 在LSCC 中起着一个重要的作用， 抑制它的表达可能对LSCC 的进展有意义。有相当多的证据证实规律地使用NSAIDs 能够使这些肿瘤得到了遏制， 其机理主要是抑制生长和促进凋亡。关于COX -2的更详细的功能、信号传导和相关因素并非完全清楚。如最近有材料显示在有些肿瘤当中COX -2 能够导致VEGF 的表达上调和抑制凋亡的。但是， 喉癌细胞或其他头颈部肿瘤发生过程当中COX -2 是否能刺激VEGF 的上调和肿瘤新生血管的生成以及能否抑制凋亡尚无文献报道。诸如此类问题还有许多需要了解。因此深入探讨COX-2 在头颈部肿瘤的作用，对了解肿瘤发生的机理和以期将来在临床上攻克肿瘤， 提供理论上依据是非常必要的。在本实验中， 我们构建的重组COX-2 原核表达载体pCDNA3.1, 为研究该蛋白质在头颈部肿瘤细胞中对下游的靶蛋白的作用及相关的影响提供了进一步实验条件。医学全在.线www.med126.com
2. 材料与方法
2.1 材料
本实验中所使用的人喉癌细胞hep-2 细胞购自中国医学科学院基础所细胞室， dNTP、T4DNA Ligase （FL101)、T 载体（pT1 EASY-BLUNT SIMPLE CLONINGCB111, 3900bp)、大肠肝菌菌株是Ecoli DH5α 等均购自北京全式金生物有限公司。限制性内切酶Hind III （Code No.:1060A, TaKaRa)， XbaI （Code No.:D1093A, TaKaRa) 购自宝生物工程大连有限公司。氨苄青霉素购自上海生工公司。PCR 反应中使用的Taq 酶是高保真DNA 聚合酶 （Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase, F-530S, New England Biolabs, Inc.)， 购自NEB 公司中国分公司。RT-PCR 试剂盒购自Fermentas 公司 （RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kits#K1621.Fermentas, Co. Ltd., Fermentas International inc. Canada)，使用的质粒是穿梭质粒，pCDNA3.11（+) （Invitrogen. Co. Ltd. Catalog nos V790-20 and V795-20) 购自Invitrogen.公司中国分公司。
