生物化学与分子生物学-实验指导:实验十九 二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮含量

实验十九  二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮含量

【实验目的】

血清尿素氮的测定方法有多种，熟悉掌握二乙酰一肟法测定血清尿素氮的基本原理；掌握二乙酰一肟法测定血清尿素氮的基本实验过程。

【实验原理】

血中尿素（urea)可与双乙酰反应生成二嗪衍生物（diazine derivative)的有色复合物，颜色深浅正比于尿素含量。与同样处理之尿素氮标准液比色，可求得血中尿素氮含量。由于双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一肟（diacetyl monoxime)来代替。其反应式如下：

反应中产生的羟胺是干扰物质，故须用氧化剂（硫酸、磷酸等)将其氧化除去。此外，提高酸的浓度可提高显色反应的灵敏度，所以反应在强酸中进行。

在显色反应中产生的有色复合物存在着对光不稳定的问题。加入硫氨脲（thiosemicarbazide)，既能提高尿素与双乙酰反应的灵敏度，又能增加其显色的稳定性。硫氨脲如果结合三价铁离子或镉离子一起使用更能提高灵敏度。

临床意义：尿素是体内蛋白质分解代谢的终产物之一，主要通过肾经尿排出体外。当肾功能障碍时，尿素排出受阻，血中尿素氮浓度增高。另外，消化道出血，严重呕吐、腹泻等导致有效血容量减少的疾患，血清尿素氮浓度也会升高。临床上尿素氮测定常作为肾功能状况的辅助诊断指标之一。

【实验试剂和器材】

1．试剂

⑴ 酸性试剂：在1000mL容量瓶中加入蒸馏水约100 mL，然后加入浓硫酸44 mL及85%磷酸66 mL，冷却至室温后，加入硫氨脲（thiosemicarbazide)50 mg及硫酸镉（cadmium sulfate，3CdSO₄•8H₂O)2g，溶解后用蒸馏水稀释至1000 mL刻度。置于棕色瓶中放冰箱内可保存半年。

⑵ 2%二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟（diacetyl monoxime)20 g，加蒸馏水约900 mL，溶解后再用蒸馏水稀释至1000 mL。贮于棕色瓶中放冰箱可保存半年。

⑵ 尿素氮贮存标准液（1mL0.2 mg氮)：准确称取尿素42.8 mg，加少量蒸馏水溶解后移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

⑶ 尿素氮应用标准液（1mL0.02 mg氮)：取贮存液10.0 mL，放入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

2．器材

⑴ 试管及试管架。

⑵ 吸量管。

⑶ 水浴锅。

⑷ 722型分光光度计。

【实验步骤】

1．取试管3支，编号，按下表进行操作：

摇匀，置沸水浴中加热15分钟，取出,置冷水中冷却5分钟；用540nm波长进行比色，以空白管调零点，读取测定管和标准管光密度。

2．列公式并进行计算（分别用两种浓度单位mmol/L和mg%，计算血清尿素氮的含量)。

正常值：正常人血清尿素氮含量为1.79~6.79 mmol/L（5~19 mg%)。

【实验注意事项】

 1. 该实验反应必须在强酸中进行，而且要加热。

 2. 实验涉及到微量定量，因此吸量管取量一定要准确。

 3. 注意两种浓度单位mmol/L和mg%的医学招聘网换算。

【思考题】

1. mmol/L与mg%的换算过程中为什么要除以28？

2. 实验反应为什么必须在强酸中进行？强酸在反应中起什么作用？