第五章 酶
1926年，Summer从刀豆中分离获得了脲酶结晶，并提出酶的化学本质就是一种蛋白质。后来Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，进一步确认酶的蛋白质本质。现在已经发现生物体内存在的酶有数千种，并有数百种酶已得到了结晶。
绝大多数酶的本质是蛋白质或蛋白质与辅酶的复合体。最近发现某些RNA分子也具有酶活性，并将这些化学本质为RNA的酶称为核糖酶(ribozymes)。从而打破了所有酶的化学本质都是蛋白质的传统概念。
由于酶的独特的催化功能，使它在工、农业和医疗卫生等领域具有重大实际意义。酶的高效率和专一性，及其不需要在高温、强酸、强碱的条件下的作用是普通的化学催化反应所无法比拟的。其研究成果给催化理论、催化剂的设计、药物的设计和作用原理的了解、疾病的诊断和治疗、以及遗传和变异等方面提供了理论依据和新的概念。
第一节 酶是生物催化剂
一、 酶的生物学意义
大多数酶是生物细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂；但是近10年来的研究表明RNA也是一种真正的生物催化剂。抗体酶(abzyme)是专一作用于抗原分子的，有催化活性的，有特殊生物功能的蛋白质。因此酶(enzyme)是生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。
生物体内一切化学反应，几乎都是在酶催化下进行的，只要有生命的地方，就有酶在起作用，生命不能离开酶而存在。酶量与酶活性的改变都会引起代谢的异常乃至生命活动的停止。
酶和一般催化剂一样，仅能催化或加速热力学上可能进行的反应，酶绝不能改变反应的平衡常数。酶本身在反应前后不发生变化。
酶与一般的催化剂不同，有许多特点：①酶的主要成分是蛋白质，极易受外界条件的影响，例如对热非常敏感，容易变性失去催化活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件，如常温、常压、接近中性的酸碱度等。②酶的催化效应非常高，酶促反应比相应的非酶促反应要快103～1017倍，如存在于血液中的碳酸酐酶催化效率是每个酶分子在一秒钟内，可以使105个二氧化碳分子发生水合反应生成碳酸，比非酶反应要快107倍。③酶具有高度的专一性，酶对所作用的物质(称为底物)有严格的选择性，通常一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质，这也说明酶对底物的化学结构和空间结构有高度严格要求。④酶的催化活性是受到调节和控制的。它的调控方式很多，包括反馈调节、抑制剂调节、共价修饰调节、酶原激活及激素控制等。⑤酶可催化某些特异的化学反应，体内某些物质的合成只能由酶促反应完成。如某些蛋白质、多肽、核酸以及其他一些生物活性物质的合成都要通过酶促反应进行。
二、 酶作用的专一性
一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键，以促进一定的化学变化，生成一定的产物。受酶催化的化合物称为该酶的底物(substrate)或作用物。酶对底物的专一性(specificity)通常分为以下几种：
1. 立体化学专一性 是从底物的立体化学性质来考虑的一种专一性。可分为两类：
(1) 旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中一种。例如L-氨基酸氧化酶只催化L-氨基酸氧化，对D-氨基酸无作用。精氨酸酶只催化L-精氨酸水解，对D-精氨酸则无效。
底物分子没有不对称碳原子，而酶促反应产物含有不对称碳原子时，该底物受酶催化后，往往只得到一种旋光异构体。如丙酮酸受乳酸脱氢酶催化还原时，只产生L-乳酸。
丙酮酸 L-乳酸
酶的立体专一性在实践中很有意义，例如某些药物只有某一种构型才有生理效应，而有机合成的药物一般是消旋产物，若用酶便可进行不对称合成或不对称拆分。如用乙酰化酶制备L-氨基酸时，将有机合成的D，L-氨基酸经乙酰化后，再用乙酰化酶处理，这时只有乙酰-L-氨基酸被水解，于是便可将L-氨基酸与乙酰-D-氨基酸分开。
(2) 几何异构专一性：有些酶对于顺反异构体只能作用其中之一，这称为几何异构专一性。例如，延胡索酸酶只催化延胡索酸(反丁烯二酸)加水生成L-苹果酸，对顺丁烯二酸(马来酸)则无作用。
延胡索酸（反丁烯二酸) L-苹果酸
2. 非立体化学专一性 如果一个酶不具有立体化学专一性，则可从底物的化学键及组成该键的基团来考虑其专一性。如以A-B为底物，可认为它是由三部分所组成，即A、B与连接它们的键。非立体化学专一性可依据酶对这三种组成部分选择程度的不同而分为三类。
(1) 键专一性：在键专一性中，对酶来说，重要的是连接A和B的键必须“正确”。例如，酯酶的作用键必须是酯键，而对构成酯键的有机酸和醇(或酚)则无严格要求。
(2) 基团专一性：具有基团专一性的酶除了需要有“正确”的化学键以外，还需要基团A和B中的一侧必须“正确”。基团专一性又称相对专一性。如胰蛋白酶作用于蛋白质的肽键，此肽键的羰基必须由赖氨酸或精氨酸所提供，而对肽键的氨基部分不严格要求。胰蛋白酶作用如下式：
(3) 绝对专一性：具有绝对专一性的酶要求底物的键和A、B都必须严格的“正确”，否则无作用。如脲酶只催化尿素的水解，对其他一切尿素的衍生物都不起作用。
为解释酶作用的专一性，Fischer曾提出“锁钥学说”，认为酶与底物之间在结构上就像一把钥匙插入到一把锁中去一样有严格的互补关系。但越来越多的事实说明，当底物与酶互补结合时，酶分子本身不是固定不变的，而是通过“诱导契合”作用实现的，这就是Koshland提出的“诱导契合”学说(induced fit theory)，该学说认为：酶分子与底物的契合是动态的契合，当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于同底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合，进行反应(见图5-1)。近年来X-线衍射分析的实验结果支持这一学说，证明了酶与底物结合时，确有显著的构象改变。以X-线衍射分析发现未结合底物的自由羧肽酶与结合了甘氨酰酪氨酸底物的羧肽酶在构象上有很大的区别。溶菌酶和弹性蛋白酶的X-线衍射分析也得到类似的结果。这些都是“诱导契合”学说的有力证明。
图5-1 酶与底物结合的诱导契合模型
三、 酶的分类与命名
(一) 酶的分类
按照国际酶学委员会(IEC)的规定，酶按催化反应的类型可分六大类：
(1) 氧化还原酶类(oxidoreductases)：催化氧化还原反应。
(2) 转移酶类(transferases)：催化功能基团的转移。
(3) 水解酶类(hydrolases)：催化水解的反应。
(4) 裂合酶类(lyases)：催化水、氨或二氧化碳的去除或加入。
(5) 异构酶类(isomerases)：催化各种类型的异构作用。
(6) 合成酶类(ligases)：催化消耗ATP的成键反应。
在此基础上，每一大类又可根据酶作用底物的性质进一步细分为各种亚类，乃至亚亚类。
(二) 酶的命名
1. 习惯命名法
(1) 一般采用底物加反应类型而命名，如蛋白水解酶、乳酸脱氢酶、磷酸己糖异构酶等。
(2) 对水解酶类，只用底物名称即可，如蔗糖酶、胆碱酯酶、蛋白酶等。
(3) 有时在底物名称前冠以酶的来源，如血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶、唾液啶粉酶等。
2. 系统命名法 鉴于新酶的不断发现和过去文献中对酶命名的混乱，国际酶学委员会规定了一套系统命名法，使一种酶只有一种名称。它包括酶的系统命名和4个用数字分类的酶编号，例如对催化下列反应的酶命名：
该酶的正式系统命名是：ATP：葡萄糖磷酸转移酶，表示该酶催化从ATP中转移1个磷酸基团到葡萄糖分子上的反应。它的分类数字是：E.C 2.7.1.1.，E.C代表按国际酶学委员会的规定命名，第1个数字2代表酶的分类名称(转移酶类)，第2个数字7代表亚类(磷酸转移酶类)，第3个数字1代表亚亚类(以羟基作为受体的磷酸转移酶类)，第4个数字1代表D-葡萄糖作为磷酸基的受体。
国际酶学委员会规定，在以酶作为主要论题的文章里，应该把它的编号、系统命名和来源在第一次叙述时写出，以后可按习惯，采用习惯命名或系统命名的名称。
第二节 酶的结构与功能
一、 酶的化学组成
酶和其他蛋白质一样，根据其组成成分可分为简单蛋白质和结合蛋白质两类。
有些酶的活性仅仅决定于它的蛋白质结构，如水解酶类(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、脲酶等)，这些酶的结构由简单蛋白质构成，故称为单纯酶；另一些酶，其结构中除含有蛋白质外，还含有非蛋白质部分，如大多数氧化还原酶类，这些酶由结合蛋白质构成，因而称为结合酶(conjugated enzyme)。在结合酶中，蛋白质部分称为酶蛋白(apoenzyme)，非蛋白部分统称为辅因子(cofactor)。辅因子又可分成辅酶(coenzyme)和辅基(prosthetic group)两类。酶蛋白与辅因子结合成的完整分子称为全酶(holoenzyme)，即全酶=酶蛋白+辅助因子(辅酶或辅基)。只有全酶才有催化活性，将酶蛋白和辅助因子分开后均无催化作用。
根据酶蛋白的特点和分子大小又把酶分成三类：
1. 单体酶 单体酶只有一条多肽链。属于这类的酶很少，大多是催化水解反应的酶，它们的分子量较小，约为13 000～35 000。这类酶有核糖核酸酶、胰蛋白酶、溶菌酶等。
2. 寡聚酶 这类酶由几条至几十条多肽链亚基组成，这些多肽链或相同，或不同。多肽链之间不是共价结合，彼此很容易分开。寡聚酶分子量从35 000到几百万。己糖激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶等属于这类酶。
3. 多酶体系 多酶体系是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连续进行。这类多酶复合物的分子量很高，一般都在几百万以上。在脂肪酸合成中的脂肪酸合成复合体就是一种多酶体系。
二、 酶的辅助因子
酶的辅助因子包括辅酶和辅基。这是按其与酶蛋白结合的牢固程度来区分的。与酶蛋白结合比较疏松(一般为非共价结合)并可用透析方法除去的称为辅酶(coenzyme,Co)；与酶蛋白结合牢固(一般以共价键结合)，不能用透析方法除去的称为辅基(prosthetic group)。也有人主张根据辅酶或辅基参与酶促反应时，它们所需要的条件不同来区别它们。
辅酶及辅基从其化学本质来看可分为三类：一类为无机金属元素，如铜、锌、镁、锰、铁等(表5-1)；另一类为小分子的有机物，如维生素、铁卟啉等。维生素是一类在有机体中含量很少，但具有重要生理功能的物质。多数维生素及其衍生物在活细胞中主要是构成许多酶的辅酶或辅基；还有一类是蛋白质辅酶。
体内酶的种类很多，而辅酶(或辅基)的种类却较少。通常一种酶蛋白只能与一种辅酶结合而成为一种专一性结合酶。但一种辅酶往往能与不同的酶蛋白构成许多不同专一性的结合酶。例如NAD+和NADP+可与许多种酶蛋白构成多种专一性不同的脱氢酶类。可见决定酶催化作用的专一性和高效率是酶蛋白部分，而辅酶或辅基在酶促反应中常参与特定的化学反应，它们决定酶促反应的类型。辅酶和辅基在酶促反应中主要起着递氢、传递电子或转移某些化学基团的作用。
表5-1 酶分子中含有或需要的无机元素举例
| 无机元素 | 酶 |
| Fe2+或Fe3+ | 细胞色素 |
| Cu2+ | 细胞色素氧化酶 |
| Zn2+ | 羧基肽酶 |
| Mg2+ | 己糖激酶 |
| Mn2+ | 精氨酸酶 |
| Ca2+ | α-淀粉酶(也需Cl-) |
| K+ | 丙酮酸激酶(也需Mn2+或Mg2+) |
| Na+ | 质膜ATP酶(也需K+及Mg2+) |
| Mo3+ | 黄嘌呤氧化酶 |
| Se | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
(一) 无机离子对酶的作用
有些酶本质是金属蛋白质，金属离子与酶蛋白牢固结合，如黄嘌呤氧化酶中含Cu2+、Mo3+；有些酶本身不含金属离子，必须加入金属离子才有活性，称金属活化酶。此种金属离子也常称为激活剂(activator)，如Mg2+可活化各种激酶。无机离子在酶分子中的作用有以下几方面：
(1) 无机离子维持酶分子活性构象，甚至参与活性中心，如羧基肽酶A中的Zn2+。
(2) 无机离子在酶分子中通过本身的氧化还原而传递电子，如各种细胞色素中的Fe3+与Cu2+。
(3) 无机离子在酶与底物之间起桥梁作用，将酶与底物连接起来，如各种激酶依赖Mg2+与ATP结合，再发挥作用。
(4) 利用离子的电荷影响酶的活性，如中和电荷等。α-淀粉酶利用Cl-中和电荷，以利酶与淀粉结合。
(二) 维生素与辅酶的关系
维生素(vitamin)是一类维持细胞正常功能所必需的小分子有机化合物，动物体内不能合成或合成不足，必须由食物供应或补充。
维生素分脂溶性和水溶性两大类。脂溶性维生素有A、D、E、K四族，各有其重要生理功能。在水溶性维生素中，除维生素C外，总称为B族维生素。几乎所有的B族维生素，均参与辅酶组成，因此也是许多酶发挥其催化活性所必要的组成部分。
B族维生素参与组成的辅酶及其作用见表5-2。
表5-2 B族维生素及其辅酶形式
| B族维生素 | 酶 | 辅酶形式 | 辅因子的作用 |
| 硫胺素(B1) | α-酮酸脱羧酶 | 焦磷酸硫胺素(LTPP) | α-酮酸氧化脱羧酮基转移作用 |
| 硫辛酸 | α-酮酸脱氢酶系 |
| α-酮酸氧化脱羧 |
| 泛酸 | 乙酰化酶等 | 辅酶A(CoA) | 转移酰基 |
| 核黄素(B2) | 各种黄酶 | 黄素单核苷酸(FMN) 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) | 传递氢原子 |
| 尼克酰胺(PP) | 多种脱氢酶 | 尼克酰腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 尼克酰腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+) | 传递氢原子 |
| 生物素[H] | 羧化酶 | 生物素 | 传递CO2 |
| 甲基转移酶 | 四氢叶酸(THP) | “一碳基团”转移 | |
| 钴铵素(B12) | 甲基转移酶 | 5-甲基钴铵素，5-脱氧腺苷钴铵素 | 甲基转移 |
| 吡哆醛(B6) | 转氨酶 | 磷酸吡哆醛 | 转氨、脱羧、消旋反应 |
某种维生素不足时可发生相应的缺乏症。有些维生素缺乏症的生化机制尚不完全清楚。B族维生素缺乏往往会导致各种酶促反应的障碍，以致代谢失常。
(三) 蛋白质类辅酶
某些蛋白质起辅酶作用，它们自身不起催化作用，但为某些酶所必需。这些辅酶称基团转移蛋白(group transfer proteins)或蛋白质类辅酶(protein coenzyme)，他们一般是较小的分子，而且比多数酶具有更高的热稳定性。蛋白质类辅酶参与基团转移反应或氧化还原反应，主要是通过递氢或递电子而起作用。金属离子、铁硫复合体(iron-sulfur cluster)和血红素(heme group)通常是存在于这些蛋白质类辅酶中的反应中心。如细胞色素是含有血红素辅基的蛋白质类辅酶。有些蛋白质类辅酶含有两个硫醇侧链(thiol side chains)的反应中心。如硫氧还原蛋白(thioredoxins)，分子中具有半胱氨酸残基相同的结构形式(—Cys—X—X—Cys)这些半胱氨酸残基的硫醇侧链(巯基)在可逆氧化还原反应中，可形成胱氨酸的二硫键，在光合成和核糖核苷酸合成中，硫氧还原蛋白就是一种还原剂。双硫键反应中心位于硫氧还原蛋白的分子表面，有利于促进形成酶的活性中心。硫氧还原蛋白在二磷酸核苷酸还原成二磷酸脱氧核糖核苷酸中的作用见图5-2。
图5-2 二磷酸核糖核苷酸的还原
(包括三种蛋白参加：黄素蛋白硫氧还原蛋白还原酶，硫氧还原蛋白和核糖核苷酸还原酶)
三、 酶的结构与功能
酶的分子结构是酶功能的物质基础，各种酶的生物学活性之所以有专一性和高效性，都是由其分子结构的特殊性决定的。酶的催化活性不仅与酶分子的一级结构有关，而且与其高级结构有关。
(一) 酶的活性中心和必需基团
实验证明，酶的催化活力只集中表现在少数特异氨基酸残基的某一区域，如木瓜蛋白酶由212个氨基酸残基组成，当用氨基肽酶从N端水解掉分子中的2/3肽链后，剩下的1/3肽链仍保持活性的99%，说明木瓜蛋白酶的生物活性表现集中在肽链C端的少数氨基酸残基及其所构成的空间结构区域。这些特异氨基酸残基比较集中并构成一定构象，此结构区域与酶活性直接相关称为酶的活性中心(active center)，所以酶的活性中心是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。一般处于酶分子的表面或裂隙中，酶的活性中心的化学基团，实际上是某些氨基酸残基的侧链或肽链的末端氨基和羧基，这些基团一般不集中在肽链的某一区域，更不互相毗邻，往往在一级结构相距较远，甚至可分散在不同链上。主要依靠酶分子的二级和三级结构的形成(即肽链的盘曲和折叠)才使这些在一级结构上互相远离的基团靠近，集中于分子表面的某一空间区域，故“活性中心”又称“活性部位”(active site)。对于需要辅酶或辅基的酶，其辅助因子也是活性中心的重要组成部分。某些含金属的酶，其中的金属离子也属于活性中心的一部分。
酶的活性中心内的一些化学基团，是酶发挥催化作用与底物直接作用的有效基团，故称为活性中心内的必需基团(essential group)。但酶活性中心外还有一些基团虽然不与底物直接作用，却与维持整个分子的空间构象有关，这些基团可使活性中心的各个有关基团保持最适的空间位置、间接地对酶的催化作用发挥其必不可少的作用，这些基团称为活性中心外的必需基团。
就功能而论，活性部位内的几个氨基酸侧链基团，又可分为底物结合部位和催化部位。底物结合部位是与底物特异结合的有关部位，因此也叫特异性决定部位。催化部位直接参与催化反应，底物的敏感键在此部位被切断或形成新键，并生成产物(图5-3)。
催化部位和底物结合部位并不是各自独立存在的，而是相互关联的整体。往往催化效率能否充分发挥，在很大程度上，取决于底物结合的位置是否合适。也就是说，底物结合部位的作用，不单单是固定底物，而且要使底物处于被催化的最优位置。因此，酶的催化部位与底物结合部位之间的相对位置是很重要的。所以酶的活性中心与酶蛋白的空间构象的完整性之间，是辩证统一的关系。当外界物理化学因素破坏了酶的结构时，首先就可能影响活性中心的特定结构，结果就必然影响酶活力。
综上所述，酶的结合部位、催化部位和必需基团，在酶的催化作用上都是重要的，它们之间的关系如下：
具有相似催化作用的酶往往有相似的活性中心。如多种蛋白质水解酶的活性中心均含有丝氨酸和组氨酸残基，处于这两个氨基酸附近的氨基酸残基顺序也十分相似。有此酶在一条酶蛋白肽链上可以有多个活性中心，能完成多种催化功能，称为多功能酶(multifunctional enzyme)，如肝脂肪酸合成酶有七个酶活性中心、协同作用使脂肪酸快速有序地合成。
(二) 酶的活性中心与酶作用的专一性
酶作用的专一性主要取决于酶活性中心的结构特异性。如胰蛋白酶催化碱性氨基酸(Lys和Arg)的羧基所形成的肽键水解，胰凝乳蛋白酶则催化芳香族氨基酸(Phe.Tyr.和Trp.)的羧基所形成的肽键水解。X线衍射显示胰蛋白酶分子的活性中心线丝氨酸残基附近有一凹隙，其中有带阴电荷的天冬氨酸侧链(为结合基团)，故易与底物蛋白质中带阳电荷的碱性氨基酸侧链形成盐键而结合成中间产物；而胰凝乳蛋白酶凹陷中则有非极性氨基酸侧链，可供芳香族侧链或其他大的非极性脂肪族侧链伸入。通过疏水作用而结合，故这两种蛋白酶有不同的底物专一性。
(三) 空间结构与催化活性
酶的活性不仅与一级结构有关，并且与其空间结构紧密相关，在酶活性的表现上，有时空间结构比一级结构更为重要。因为活性中心需借助于一定的空间结构才得以维持。有时只要酶活性中心各基团的空间位置得以维持就能保持全酶的活性，而一级结构的轻微改变并不影响酶活性。如：牛胰核糖核酸酶由124氨基酸残基组成，其活性中心为组12及组119，当用枯草杆菌蛋白酶将其中的丙20-丝21的肽键水解后：得到N端20肽(1～20)和另一104肽(21～124)两个片段，前者称S肽，后者称S蛋白。S肽含有组12，而S蛋白含有组119，两者单独存在时均无活力，但在pH 7.0介质中，使两者按1∶1重组时，两个肽段之间的肽键并未恢复，但酶活性却能恢复。这是S肽通过氢键及疏水键与S蛋白结合，使组12又与组119互相靠近，恢复了表现酶活力的空间构象的缘故(图5-4)。由此可见保持活性中心的空间结构是维持酶活性所必需的。
(四) 酶原的激活
某些酶(绝大多数是蛋白酶)在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些无活性的酶的前身称为酶原(zymogen)，使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活(zymogen activation)。酶原的激活机制主要是分子内肽链的一处或多处断裂，同时使分子构象发生一定程度的改变，从而形成酶活性中心所必需的构象。如胰蛋白酶原在激活过程中，赖氨酸-异亮氨酸之间的肽键被打断，失去一个六肽，断裂后的N端肽链的其余部分解脱张力的束缚。使它能像一个放松的弹簧一样卷起来，这样就使酶蛋白的构象发生变化，并由于把与催化有关的组氨酸46、天冬氨酸90带至丝氨酸183附近，形成一个合适的排列，因而就自动地产生了活性中心。激活胰蛋白酶原的蛋白水解酶是肠激酶，而胰蛋白酶一旦生成后，也可自身激活。胰蛋白酶原激活过程的模式图见图5-5。
图5-4 牛胰核糖核酸酶分子的切断与重组
图5-5 胰蛋白酶原激活过程示意图
除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的酶类，也都以酶原的形式存在。酶原激活的生理意义在于避免细胞产生的蛋白酶对细胞进行自身消化；并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行。
第三节 酶的作用机制
一、 酶能显著降低反应活化能
在任何化学反应中，只有那些含能量达到或超过一定限度的“活化分子”才能发生变化、形成产物。能引起反应的最低的能量水平称反应能阀(energy barrier)，分子由常态转变为活化状态所需的能量称为活化能(activation energy)。活化能是指在一定温度下，1mol反应物达到活化状态所需要的自由能，单位是焦耳/摩尔(J/mol)，化学反应速度与反应体系中活化分子的浓度成正比。反应所需活化能愈少，能达到活化状态的分子就愈多，其反应速度必然愈大。催化剂的作用是降低反应所需的活化能，以致相同的能量能使更多的分子活化，从而加速反应的进行。
酶能显著地降低活化能，故能表现为高度的催化效率(图5-6)。例如H2O2的分解，在无催化剂时，活化能为75kJ/mol，用胶状钯作催化剂时，只需活化能50kJ/mol，当有过氧化氢酶催化时，活化能下降到8kJ/mol。
二、 中间复合物学说和酶作用的过渡态
大量资料证明，在酶促反应中，酶(E)总是先与底物(S)形成不稳定的酶-底物复合物(ES)，再分解成酶(E)和产物(P)，E又可与S结合，继续发挥其催化功能，所以少量酶可催化大量底物。
酶 底物 中间产物 酶 产物
由于E与S结合，形成[ES]，致使S分子内的某些化学键发生极化呈现不稳定状态或称过渡态(transition states)，大大降低了S的活化能，使反应加速进行。在双底物反应中，其进程如下式：
酶的活性中心不仅与底物结合，而且与过渡态中间物结合，其结合作用比底物与活性中心的结合更紧，当形成过渡态中间复合物时，要释放一部分结合能，使过渡态中间物处于更低的能级，因此整个反应的活化能进一步降低，反应大大加速。
底物同酶结合成中间复合物是一种非共价结合，依靠氢键、离子键，范德华力等次级键来维系。
三、 酶作用高效率的机制
不同的酶可有不同的作用机制，并可有多种机制共同作用。
(一) 底物的“趋近”和“定向”效应
“趋近”效应(approximation) 系指A和B两个底物分子结合在酶分子表面的某一狭小的局部区域，其反应基团互相靠近，从而降低了进入过渡态所需的活化能，这种效应称为“趋近”效应。显然，“趋近”效应大大增加了底物的有效浓度。由于化学反应速度与反应物的浓度成正比，在这种局部的高浓度下，反应速度将会相应提高。
酶催化反应的“趋近”效应，使得酶表面某一局部范围的底物有效浓度远远大于溶液中的浓度，曾测到过某底物在溶液中的浓度为0.001mol/L，而在某酶表面局部范围的浓度高达100mol/L，比溶液中浓度高105倍左右。
酶不仅能使反应物在其表面某一局部范围互相接近，而且还可使反应物在其表面对着特定的基团几何地定向，即具有“定向”效应(oreintation)(图5-7)。因而反应物就可以用一种“正确的方式”互相碰撞而发生反应。
图5-7 底物的“趋近”和“定向”效应示意图
另外，从分子间反应转为分子内反应可加大反应速度的角度来看，也可以加深对“趋近”“定向”效应的理解。例如乙酸苯酯的催化水解以叔胺为催化剂，由分子间转为分子内反应，反应速度可提高1000倍。
总之，酶可以通过“趋近”效应和“定向”效应使一种分子间的反应变成类似于分子内的反应，使反应得以高速进行。
(二) 底物变形与张力作用
酶与底物结合后，使底物的某些敏感键发生“变形”(distortion)，从而使底物分子接近于过渡态，降低了反应的活化能，同时，由于底物的诱导，酶分子的构象也会发生变化，并对底物产生张力作用(strain)使底物扭曲，促进ES进入过渡状态(图5-8)。
图5-8 酶的张力作用使底物分子扭曲
(三) 共价催化作用
某些酶与底物结合形成一个反应活性很高的共价中间产物，这个中间产物以较大的几率，转变为过渡状态，因此反应的活化能大大降低，底物可以越过较低的能阈而形成产物。共价催化作用可分为亲核催化作用和亲电子催化作用两大类。
1. 亲核催化作用 亲核催化是指具有一个非共用电子对的基团或原子，攻击缺少电子具有部分正电性的原子，并利用非共用电子对形成共价键催化反应。酶分子中具有催化功能的亲核基团主要是：组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基及半胱氨酸的巯基。此外，许多辅酶也具有亲核中心。
亲核催化作用中的最重要一类是有关酰基转移的亲核催化作用。这类酶分子中的亲核基团能首先接受含酰基的底物如酯类分子中的酰基，形成酰化酶中间产物，接着酰基从中间产物转移到最后的酰基受体分子上，酰基受体可能是某种醇或水分子。在亲核催化反应进行时，底物的酰基转移给酶(见下列式②)的速度较直接转给最终酰基受体(式①)快得多，酰化酶与最终酰基受体起反应(式③)的速度也较反应①快。酶促催化两步反应的总速度要比非催化反应大得多。因此形成不稳定的共价中间产物，可以大大加速反应。
非催化反应：
含酰基的反应物 最终酰基受体 产物
含亲核基团的酶催化的反应：
（含羟基的酶)酰化了的酶
2. 亲电子催化作用 在亲电子催化作用中，催化剂和底物的作用与亲核催化相反，就是说，亲电子催化剂从底物中吸取一个电子对。酶分子亲电子的基团有亲核碱基被质子化的共轭酸，如—NH3+。
在酶的亲电子催化过程中。有时其必需的亲电子物质不是上述的共轭酸，而是由酶中非蛋白组成的辅因子提供，其中金属阳离子是很重要的一类。
(四) 酸碱催化作用
酸碱催化剂有两种， 一是狭义的酸碱催化剂，即H+与OH。 由于酶反应的最适pH一般接近于中性，因此H+及OH-的催化作用在酶促反应中的重要性比较有限。而广义的酸碱催化剂作用，即质子受体与质子供体的催化在酶促反应中的重要性较大。细胞内许多有机反应均属广义酸碱催化作用。在酶分子上有许多酸性或碱性基团，它们可作为质子供体或质子受体，在特定条件下起催化作用。这些反应包括羰基的加水，羧酸酯和磷酸酯的水解，双键的脱水反应，各种分子的重排及取代反应等。已知酶分子中含有几种功能基团，可以起广义酸碱催化作用，如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等。
影响酸碱催化反应速度的因素有两个：
第一个因素是酸碱的强度。在这些功能基中咪唑基是催化中最有效、最活泼的一个催化功能基。组氨酸咪唑基的pK’约为6.0，这意味着由咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的氢离子浓度相近，因此它在接近于生物体液pH的条件下(即在中性条件下)，有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在。也就是说，咪唑基既可以作为质子供体，又可以作为质子受体在酶促反应中发挥催化作用。
酸形式碱形式
第二个因素是这些功能基供出质子或接受质子的速度。在这方面，咪唑基又有其优越性，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半寿期小于10-10秒，而且，供出质子或接受质子的速度几乎相等。由于咪唑基有如此优点，所以，组氨酸在大多数蛋白质中虽然含量很少，却很重要。
由于酶分子中存在多种供质子或接受质子的基团，因此酶的酸碱催化效率比一般酸碱催化剂高得多。例如肽键在无酶存在下进行水解时需要高浓度的H+或OH-，和在高温下长时间的作用，而以胰凝乳蛋白酶作为酸碱催化剂时，在常温、中性pH下很快就可使肽键水解。
四、 核酶与抗体酶
(一) 核酶
核酶(ribozyme)又称催化RNA，核糖酶，类酶，酶性RNA，另有建议称“ ”(音：“海”)。核酶是具有生物催化活性的RNA。其功能是切割和剪接RNA，核酶的底物是RNA分子。其作用特点是：切割效率低，易被RNase破坏，核酶作用于RNA，包括催化转核苷酰反应，水解反应(RNA限制性内切酶反应)和连接反应(聚合酶活性)等。还可能具有氨基酸酯酶，氨基酰tRNA合成酶和肽基转移酶活性，表明核酶在翻译过程中和核糖体发挥功能中起着重要作用。
根据核苷酸序列、立体结构以及催化反应类型、核酶有以下几类：
①切割反应：第一类切割反应发生在RNA前体的成熟过程中，核酶切割3"-OH和5"-磷酸末端，如RNase P能切除tRNA前体5"-端的附加序列；第一类切割反应发生在植物类病毒的环状单链卫星RNA和线性卫星RNA的复制过程中，在滚环式的RNA复制过程中的最后一步，这些RNA进行自我催化的裂解切割反应，如发卡核酶能把以环形正链RNA为模板所复制出的负链多拷贝串联体裂解成负链RNA单体，而发卡核酶还具有连接反应作用，可将线性的负链RNA单体环化为正链RNA复制的模板。垂头核酶所催化的裂解反应也是一个自我裂解反应，能将正链多拷贝串联体裂解成正链RNA单体。
②剪接反应：剪接反应包括了RNA的切割和连接，共有三种类型：第一类内含子自我剪接反应；第二类内含子自我剪接反应和核mRNA前体的剪接反应。
第一类内含子自我剪接反应需要Mg2+和鸟苷(或GTP)参加，剪接的第一步是鸟苷(或GTP)的—OH攻击5"-剪接位点，鸟苷共体结合到内含子的5"-端，并释放出5"-外显子；第二步是5"-外显子的3"-OH攻击3"-剪接位点，5"-外显子与3"-外显子之间形成磷酸二酯键，同时释放出线状内含子(图5-9a)，第一类内含子核酶已被应用于治疗某些由基因突变造成的遗传性疾病。这类核酶可将正确基因引入细胞内，通过剪接将突变的基因片段取代出来。
第二类内含子自我剪接需要Mg2+参加，但不需要鸟苷(或GTP)。在自我剪接的过程中，首先是位于3"-剪接位点附近的腺嘌呤核苷的OH(位于3"-剪接点上游约7～8个核苷酸处)进攻5"-剪接位点。使5"-剪接位点断开，并形成“套索”状的中间产物，然后是3"-剪接位点断开，两个外显子连接，同时释放出“套索”状内含子(图5-9b)。
核mRNA前体的剪接与第二类内含子的剪接相似，但剪接反应必须在“剪接体”中进行。有5种核内小核糖核蛋白颗粒SnRNP(u1、u2、u5、u4/u6)参加。首先是u1、u2和u5分别结合到5"-剪接位点、分支点，即含有腺苷的特征序列C，位于3"-剪接位点上游约30个核苷酸处，以及3"-剪接位点，接着u4/u6参加，与mRNA前体一起组装成完整的“剪接体”，在“剪接体”中，5"-剪接位点首先被剪开，形成游离的5"-外显子和“套索”状中间物，然后u4离开“剪接体”,3"-剪接点断开。最后5"-外显子和3"-外显子共价连接，形成成熟的mRNA和“套索”状的内含子。(图5-9c)。
图5-9 RNA催化的剪接反应
a.第一类内含子的自我剪接反应 b. 第二类内含子的自我剪接反应
c.核mRNA前体的剪接反应，方框表示外显子，直线表示内含子
核酶在阻断基因表达和抗病毒作用方面具有应用前景。
用核酶药物治疗疾病的原理是：核酶可以选择性地裂解癌细胞或病毒的RNA，从而阻断它们合成蛋白质。如针对HIV(艾滋病病毒)的RNA序列和结构，设计出专门裂解HIV病毒的RNA的核酶，而这种核酶对正常细胞RNA则没有影响。核酶是催化剂，可以反复作用，因此与反义RNA相比，核酶药物使用剂量较少，毒性也较小，而且核酶对病毒作用的靶向序列是专一的，因此病毒较难产生耐受性。
(二) 抗体酶
抗体酶(abzyme)也叫催化抗体(Catalyticantibody)，是一类新的模拟酶。根据酶与底物作用的过渡态结构设计合成一些类似物——半抗原，用人工合成的半抗原免疫动物，以杂交瘤细胞技术生产针对人工合成半抗原的单克隆抗体，这种抗体具有与半抗原特异结合的抗体特性又具有催化半抗原进行化学反应的酶活性，将这种既有酶活性又有抗体活性的模拟酶称抗体酶。抗体酶能催化某些特殊反应。例如：
(1) 酰基转移反应：在蛋白质生物合成中，氨基酸的活化反应称酰基化反应。以中性磷酸二酯作为反应过渡态的稳定类似物所制备的单抗可以催化带丙氨酰酯的胸腺嘧啶3"-OH基团的氨酰化反应，酰基转移抗体酶的研究有利于改进蛋白质的人工合成方法，合成新型tRNA。
(2) 水解反应：主要有酯水解和酰胺水解两类。蛋白质水解都是酰胺水解，如1989年Iverson等用CoⅢ-三乙烯酰胺-肽复合物作为半抗原，得到能专一切割Gly-Phe肽键的抗体酶。酯酶水解酯类是酯的羧基碳原子受到亲核攻击、形成四面体过渡态，过渡态的最终断裂即形成水解产物。以四面体过渡态磷酸酯类似物为半抗原，所得到的抗体能催化酯的水解。
迄今，已开发出近百种抗体酶，除了上述例举的反应外，尚有多种催化反应类型的抗体酶如：
①有机酸、碳酸酯水解反应；
②立体选择性内酯反应；
③氧化还原反应和金属螯合反应；
④胸腺嘧啶二聚体裂解反应；
⑤分支酸变位反应；
⑥β-消除反应；
⑦卟啉金属取代反应
⑧原子重排反应与光诱导反应等。
抗体酶具有较高的催化活力和较好的专一性，能够根据人们的意愿设计出天然蛋白酶所不能催化的反应，用以催化在结构上有差异的底物，为研究开发特异性强的治疗药物开辟了广阔前景。
第四节 酶促反应的动力学
酶促反应的动力学是讨论酶催化反应的速度及各种因素对反应速度的影响。这对研究酶的作用机制有重要意义。影响酶促反应速度的因素很多，诸如温度、氢离子浓度、底物浓度、酶浓度、抑制剂和激活剂等。
一、 底物浓度对酶反应速度的影响
根据Henri的“酶-底物中间复合体”学说，酶促反应中，酶先与底物形成中间复合物，再转变成产物，并重新释放出游离的酶。
在酶浓度恒定的条件下，当底物浓度很小时，酶未被底物饱和，这时反应速度取决于底物的浓度，底物浓度越大，单位时间内ES生成也越多，而反应速度取决于ES的浓度，故反应速度也随之增高。当底物浓度加大后，酶逐渐被底物饱和，反应速度的增加和底物的浓度就不成正比，继而底物增加至极大值，所有酶分子均被底物饱和，所有的E均转变成ES，此时的反应速度不会进一步增高。因此，当[S]对V作图时，就形成一条双曲线(图5-10)。
图5-10的曲线可分为三段：
第一段：反应速度与底物浓度呈正比关系，表现为一级反应。
第二段：为介于零级及一级之间的混合级反应。
第三段：已接近于零级反应，当底物浓度远远超过酶浓度([S])>>[E])时，反应速度也达极限值即V=Vmax(最大速度)
(一) 米氏方程及其推导
根据中间复合物理论，Michaelis和Menten对图5-10的曲线加以数学处理，提出酶促反应动力学的基本原理，即米氏方程：
V=
米氏方程反映了底物浓度与酶促反应速度间的定量关系，式中Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数，V为底物浓度不足以产生最大速度时的反应速度。
根据上述理论和单底物反应、酶促反应可按下式进行：
.gif){kind=small}
式中K1、K2分别为E+S ES正逆反应两方向的速度常数，K3为ES形成P+E的速度常数。由于反应处于初速度阶段时，S的消耗很少，产物P的量极少，故由P+E逆行而重新生成ES的可能性可不予考虑，此时反应速度取决于ES浓度：
| V=K3[ES] | (5-2) |
从式(5-1)可知，ES的生成和解离速度各为：
| ES的生成速度=K1[E][S] | (5-3) |
| ES的解离速度=(K2+K3)[ES] | (5-4) |
当处于衡定状态时，ES复合物的生成速度与分解速度相等，即得下式：
| K1[E][S]=(K2+K3)[ES] | (5-5) |
将(5-5)重排
| [ES]= | (5-6) |
将(K2+K3)/K1复合常数用Km(米氏常数)来表示，则式(5-6)成为：
| [ES]=[E][S]/Km | (5-7) |
| 如E的起始浓度为[E0]，恒态时[E]=[E0]-[ES] | (5-8) |
通常底物浓度比酶浓度过量得多，即[S]>>[E]，所以ES的形成不会明显降低[S]。故而[S]的降低可忽略不计。
将式(5-8)代入(5-7)式，得到：
| [ES]=([E0]-[ES])[S]/Km | (5-9) |
从式(5-9)中求解[ES]。
| [ES]=[E0] | (5-10) |
| 或 [ES]= | (5-11) |
将(5-11)代入式(5-2)，得
| V=K3 | (5-12) |
当[S]为极大时，全部E均转为ES，[ES]=[E0]，此时V即为最大速度Vmax，亦即V=Vmax。
| 故 Vmax=K3[E0] [E0]=Vmax/K3 | (5-13) |
将式(5-13)代入式(5-12)即得：
| V= | (5-14) |
(5-14)式就是米氏方程，它表明了底物浓度与反应速度间的定量关系。若将该式移项、加项及整理可得：VKm+V[S]=Vmax[S] (5-15)
VKm+V[S]—Vmax[S]—VmaxKm= —VmaxKm （5-16)
(V—Vmax)([S]+Km)=—VmaxKm(5-17)
因Vmax和Km均为常数，而V及S为变数，故式(5-17)实际上可写成(x-a)(y+b)=K。这是典型的双曲线方程。可见米氏方程与实际结果是相符的。
当[S]和Km相比如果小得多时，则(5-14)式分母中[S]可略去不计，而得到：V=Vmax/Km[S]。这说明反应对底物为一级反应，其速度与[S]成正比，即图5-10曲线的第一段，反之，当[S]和Km相比要大得多时，(5-14)式分母中Km可略去不计，而得到： V=Vmax[S] / [S]=Vmax，说明此时反应速度达最大的恒定值，与底物的浓度无关，反应为零级反应，即图5-10曲线的第三段。
(二) 米氏常数(Km)的意义和应用
当酶促反应处于V=1/2Vmax时，是米氏方程为：
Vmax / 2=
Km+[S]=2[S]故Km=[S]。这就是说，米氏常数Km为酶促反应速度达到最大反应速率一半时的底物浓度。它的单位是mol/L(摩尔/升)，是酶的特征性常数。当pH、温度和离子强度等因素不变时，Km是恒定的。Km值的范围一般在10-7～10-1mol/L之间。
米氏常数在酶学和代谢研究中均为重要特征数据。
(1) 同一种酶如果有几种底物，就有几个Km，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。不同的底物有不同的Km值，这说明同一种酶对不同底物的亲和力不同。一般用1 / Km近似地表示酶对底物亲和力的大小，1 / Km愈大，表示酶对该底物的亲和力愈大，酶促反应易于进行。
(2) 已知某个酶的Km，可计算出在某一底物浓度时，某www.med126.com/wszg/反应速度相当于Vmax的百分率。例如当[S]=3Km时，代入(5-14)式
V==3/4Vmax=75%Vmax
(3) 在测定酶活性时，如果要使得测得的初速度基本上接近Vmax值，而过量的底物又不至于抑制酶活性时，一般[S]值需为Km值的10倍以上。
(4) 催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km往往是不同的。测定这些Km值的差别以及细胞内正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率，这对了解酶在细胞内的主要催化方向及生理功能有重要意义。
(5) 当一系列不同的酶催化一个代谢过程的连锁反应时，如能确定各种酶的Km及其相应底物的浓度，还有助于寻找代谢过程的限速步骤。例如酶1、2、3分别催化A→B→C→D三步连锁反应，它们相对底物A、B、C的Km分别为10-2、10-3、10-4mol / L，而细胞内A、B、C的浓度均接近10-4mol，则可推知限速反应是A→B的一步。
(6) 了解酶的Km值及其底物在细胞内的浓度，可以推知该酶在细胞内是否受到底物浓度的调节。如酶的Km远低于细胞内的底物浓度(低10倍以上)，说明该酶经常处于底物饱和状态，底物浓度的稍许变化不会引起反应速度有意义的改变。反之，如酶的Km大于底物浓度，则反应的速度对底物浓度的变化就十分敏感。
(7) 测定不同抑制剂对某个酶Km及Vmax的影响，可以区别该抑制剂是竞争性还是非竞争性抑制剂(见下述)。
(三) 米氏常数的求法
从酶的V-[S]图上可以得到Vmax，再从Vmax可求得相应的[S]即为Km值。但实际上用这个方法来求Km值是行不通的，因为即使用很大的底物浓度，也只能得到趋近于Vmax的反应速度，而达不到真正的Vmax，因此测不到准确的Km值。为了得到准确的Km值，可以把米氏方程的形式加以改变，使它成为相当于y=ax+b的直线方程，然后用外推法求出Km值。
1. Lineweaver Burk方程(双倒数作图法)
将米氏方程两边取倒数：
=
即
=
+
(5-18)
右式即称为Lineweaver Burk方程。这一线性方程，用对
作图即得到一条直线(图5-11)，直线的斜率为Km/Vmax，1/V的截距为1/Vmax，当1/V=0时，1/[S]的截距为—
。
0=+
因此，=
=—
2. Hanes作图法
(5-18)式的两侧均乘以[S]，可得：
[S] / V=1 / Vmax[S]+Km /Vmax(5-19)
(5-19)式也是直线方程式，称为Hanes方程式。用[S]/ V对[S]作图(5-12)，所得直线的斜率为1/Vmax，[S]/V轴上的截距为Km/Vmax，而[S]轴上的截距为—Km(因为[S]/V=0.1/Vmax[S]= —Km/Vmax，故[S]= —Km)。Hanes法的优点为数据点在坐标图中的分布较平坦，但因[S] / V包含两个变数，这就增大了误差，且统计处理也复杂得多。
图5-11 双倒数(LineweaverBurk)作图法 图5-12 Hanes作图法
二、pH的影响与最适pH
大多数酶的活性受pH影响较大。在一定pH下酶表现最大活力，高于或低于此pH，活力均降低。酶表现最大活力时的pH称为酶的最适pH。pH对不同酶的活性影响不同(图5-13)。典型的最适pH曲线是钟罩形曲线。
各种酶在一定条件下都有一定的最适pH。一般说，大多数酶的最适pH在5～8之间，植物和微生物酶的最适pH多在4.5～6.5左右，动物体内的酶其最适pH在6.5～8.0左右。但也有例外，如胃蛋白酶最适pH是1.5，肝中精氨酸酶的最适pH是9.8。
图5-13 pH对酶活性的影响
pH对酶反应速度的影响，主要有下列原因：
1. 影响酶和底物的解离 酶的活性基团的解离受pH的影响，有的酶必须处于解离状态方能很好地与底物结合，在这种情况下，酶和底物解离最大的pH有利于酶促反应的加速。如胃蛋白酶与带正电荷的蛋白质分子相结合最为敏感，乙酰胆碱酯酶也只有底物(乙酰胆碱)带正电荷时，酶与底物最易结合。相反，有的酶(如蔗糖酶、木瓜蛋白酶)则要求底物处于兼性离子时最易结合。因此，这些酶的最适pH在底物的等电点附近。所以，pH对不同酶和底物的影响不同，对其酶促反应速度的影响也就不同。
2. 影响酶分子的构象 过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，甚至会改变整个酶分子的结构使其变性失活。
三、 温度的影响与最适温度
化学反应的速度随温度增高而加快，但酶是蛋白质，可随温度的升高而变性。在温度较低时，前一影响较大，反应速度随温度的升高而加快。一般说，温度每升高10℃，反应速度大约增加1倍。但温度超过一定数值后，酶受热变性的因素占优势，反应速度反而随温度上升而减慢，形成倒U形曲线。在达到此曲线顶点所代表的温度时，反应速度最大，称为酶的最适温度(optimum temperature)(图5-14)。酶的最适温度与底物浓度、介质pH、离子强度、保温时间等许多因素有关。
四、 酶浓度的影响
在一定条件下，酶的浓度与反应初速度成正比。因为酶催化反应时，酶先要与底物形成中间物，当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度，这时增加酶浓度可增加反应速度，反应速度与酶浓度成正比关系，这种正比关系也可由米氏公式推导出来：
V=Vmax[S] / Km+[S]
又因为 Vmax=K3[E0]
所以 V=K3[E0][S]/ Km+[S]=·[E0]
如果初始底物浓度固定，则K3[S] / Km+[S]是常数，并用K"表示，故V=K"[E0]。V—[E0]作图(5-15)为一直线。这是酶活力测定的依据。
五、 激活剂的影响
凡能提高酶的活性，加速酶促反应进行的物质都称为激活剂(activator)。酶的激活剂可以是一些简单的无机离子，无机阳离子如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr3+、Fe2+等，无机阴离子如Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO43-等。Cl-是唾液淀粉最强的激活剂。RNA酶需Mg2+，脱羧酶需要Mg2+、Mn2+、Co2+为激活剂。激活作用可能有这几方面的机制：①与酶分子中的氨基酸侧链基团结合，稳定酶催化作用所需的空间结构；②作为底物(或辅酶)与酶蛋白之间联系的桥梁；③作为辅酶或辅基的一个组成部分协助酶的催化作用。
一些小分子的有机物如抗坏血酸、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等，对某些含巯基的酶具有激活作用，这是由于这些酶需要其分子中的巯基处于还原状态才具催化作用。如木瓜蛋白酶及3-磷酸甘油醛脱氢酶在分离提取过程中，其分子上的巯基较易氧化成双硫键而使活力降低，当加入上述任何一种化合物后，能使二硫键还原成巯基从而提高酶活力。还有些酶的催化作用易受某些抑制剂的影响，凡能除去抑制剂的物质也可称为激活剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)，它是金属螯合剂，能除去重金属杂质，从而解除重金属对酶的抑制作用。
激活剂的作用是相对的，一种酶的激活剂对另一种酶来说，也可能是一种抑制剂。不同浓度的激活剂对酶活性的影响也不相同。
六、 抑制剂的影响
酶分子中的必需基团(主要是指酶活性中心上的一些基团)的性质受到某种化学物质的影响而发生改变，导致酶活性的降低或丧失称为抑制作用。能对酶起抑制作用的物质称为酶抑制剂(inhibitor)。抑制剂通常对酶有一定的选择性，一种抑制剂只能引起某一类或某几类酶的抑制。抑制作用不同于失活作用。通常酶蛋白受到一些物理因素或化学试剂的影响，破坏了次级键，部分或全部改变了酶的空间构象，从而引起酶活性的降低或丧失，这是酶蛋白变性的结果，凡是使酶变性失活的因素如强酸，强碱等，其作用对酶没有选择性，不属于抑制剂。
很多药物是酶的抑制剂，通过对病原体内某些酶的抑制作用或改变体内某些酶的活性而发挥其治疗功效，了解酶的抑制作用是阐明药物作用机制和设计研究新药的重要途径。
(一) 不可逆抑制
抑制剂与酶的必需基因以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活力。抑制作用随着抑制剂浓度的增加而逐渐增加，当抑制剂的量大到足以和所有的酶结合，则酶的活性就完全被抑制。
1. 非专一性不可逆抑制 抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论是必需基团与否，皆进行共价结合。由于酶的必需基团也被抑制剂作用，故可使酶失活。
某些重金属离子(Pb2+、Cu2+、Hg2+)，有机砷化合物及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆结合，许多以巯基为必需基团的酶(称为巯基酶)，会因此而被抑制，用二巯基丙醇(british anti-lewiste,BAL)和二巯基丁二酸钠等含巯基的化合物可使酶复活。
2. 专一性不可逆抑制剂 抑制剂专一作用于酶的活性中心或其必需基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。有机磷杀虫剂专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而产生不可逆抑制酶活性，有机磷杀虫剂的结构与底物愈近似，其抑制愈快，有人称其为假底物(pseudosubstrate)。当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分解，导致乙酰胆碱过多而产生一系列胆碱能神经过度兴奋症状。解磷定等药物可与有机磷杀虫剂结合，使酶与有机磷杀虫剂分离而复活。
有些专一性不可逆抑制剂在与酶作用时，通过酶的催化作用，其中某一基团被活化，使抑制剂与酶发生共价结合从而抑制了酶活性，如同酶的自杀，此类抑制剂称为自杀底物(suicide substrate)。例如新斯的明(proftigmine)抑制胆碱酯酶时，先被胆碱酯酶水解，所产生的二甲氨基甲酰基可结合到酶活性中心的丝氨酸羟基而抑制酶活性，故有扩瞳作用。
(二) 可逆抑制
抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，可用透析等物理方法除去抑制剂，恢复酶的活性。
通常分为三种类型：
1. 竞争性抑制(competitiveinhibition) 竞争性抑制是较常见而重要的可逆抑制。它是指抑制剂(I)和底物(S)对游离酶(E)的结合有竞争作用，互相排斥，酶分子结合S就不能结合I，结合I就不能结合S。这种情况往往是抑制剂和底物争夺同一结合位置(图5-16)。此外还有些因素也可以造成两者和酶的结合互相排斥。比如，两者的结合位置虽然不同，但由空间障碍使得I和S不能同时结合到酶分子上，故不可能存在IES三联复合体。可用下式表示：
图5-16 竞争性与非竞争性抑制剂的区别
a.酶-底物复合物 b.竞争性抑制剂阻止底物与酶结合 c. 非竞争性抑制剂不阻止底物与酶结合
(5-20)式中Ks及Ki分别代表ES复合体和EI复合体的解离常数。在此反应体系中，当加入I时，可破坏E和ES的平衡，使ES→E→EI。此时再增加S的浓度，又可逆转而使EI→E→ES，故在酶量恒定的条件下，反应速度与[S]和[I]的比值有关。
根据平衡学说，(5-20)式可表示如下：
Ks=[E][S] / [ES]，故[ES]=[E][S] / Ks (5-21)
Ki=[E][I] / [EI]，故[EI]=[E][I] / Ki(5-22)
前已述及，反应的初速度V与ES的浓度成正比，而最大反应速度Vmax与酶的总浓度[E0]成正比。
即 V=K0[ES] Vmax=K0[E0] (5-23)
故 V=Vmax=[ES] / [E0](5-24)
而酶的总浓度 [E0]=[E]+[ES]+[EI] (5-25)
将(5-25)式代入(5-24)式，再将(5-21)(5-22)式中的[ES][EI]值代入(5-25)式，得
=
=
==
（5-26)
V= （5-27)
如以米氏常数Km代替Ks，则
V= （5-28)
用Lineweaver-Burk法将(5-28)式作双倒数处理，可得
=
（5-29)
(5-28)和(5-29)式是竞争性抑制作用的反应速度公式。当[S]为无限大时，(5-28)式分母中Km(1+[I] / Ki)一项可略去不计，V=Vmax，故当[S]对V作图时(图5-17a)，有I时的曲线虽较无I时的曲线向右下方移动，但在[S]为无穷大时可与无I时的曲线相交。若以1 / [S]对1/ V作图(5-17，b)，可见有I存在时的直线斜率高于无I时的斜率，增加了(1+[I]/Ki)倍。当有I时，其在横轴上的截距为—，也即Km变为Km(1+[I] / Ki)，可见有竞争性抑制剂存在时，Km增大，且Km随[I]的增加而增加，称为表观Km，以Kmapp表示。无I与有I时的两条动力学曲线在纵轴上相交，其截距为1/Vmax，即Vmax的数值不变。
竞争性抑制动力学特点为：①当有I存在时，Km增大而Vmax不变，故Km/Vmax也增大。②Kmapp随[I]的增加而增大。③抑制程度与[I]成正比，而与[S]成反比，故当底物浓度极大时，同样可达到最大反应速度。即抑制作用可以解除。
图5-17 竞争性抑制动力学图
a.[S]对V作图 b. Lineweaver-Burk双倒数作图
竞争性抑制的经典例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。
若增加底物琥珀酸的浓度，抑制作用即降低，甚至解除。
磺胺类药物也是典型的竞争性抑制剂。对磺胺敏感的细菌在生长和繁殖时不能利用现成的叶酸，只能利用对氨基苯甲酸合成二氢叶酸，而磺胺类药物与对氨基苯甲酸结构类似，竞争占据细菌体内二氢叶酸合成酶，从而抑制细菌生长所必需的二氢叶酸的合成。二氢叶酸可再还原为四氢叶酸，后者是合成核酸所必需的，磺胺抑制了细菌二氢叶酸的合成，使细菌核酸的合成受阻，从而抑制了细菌的生长和繁殖而人体能从食物中直接利用叶酸，故其代谢不受磺胺影响。
抗菌增效剂TMP可增强磺胺药的药效，因为它的结构与二氢叶酸有类似之处，是细菌二氢叶酸还原酶的强烈抑制剂，它与磺胺药配合使用，可使细菌的四氢叶酸合成受到双重阻碍，因而严重影响细菌的核酸及蛋白质合成。
竞争性抑制原理是药物设计的根据之一，如抗癌药阿拉伯糖胞苷、5-氟尿嘧啶等都是利用竞争性抑制而设计出来的。
2. 非竞争性抑制 非竞争性抑制(noncompetitive inhibition)是指底物S和抑制I与酶的结合互不相关，既不排斥，也不促进，S可与游离E结合，也可和EI复合体结合。同样I可和游离E结合，也可和ES复合体结合，但IES不能释放出产物(图5-16)。
式中KS及KS"，分别为ES及IES解离出S的解离常数，而Ki及Ki"分别为IE及IES解离出I的解离常数，当反应体系中加入I，既可使E和IE的平衡倾向IE，又可使ES与IES的平衡倾向IES，并且Ki=Ki"，故实际上并不改变E和ES的平衡，也不改变E和S的亲和力。同样在E和I的混合物中加入S，因KS=KS"，也不改变E和IE的平衡，不改变E和I的亲和力。同样根据平稳学说得：
[ES]=[E][S] / KS [IE]=[E][I] / Ki (5-30)
[IES]=[ES][I] / Ki"=[E][S][I]/ KSKi"(5-31)
或[IES]=[IE][S] / KS"=[E][I][S]/ KiKS"(5-32)
而[E0]=[E]+[ES]+[IE]+[IES] (5-33)
根据(5-24)式 =
将以上各式代入(5-24)式，再经过推导后，得到：
V= (5-34)
将(5-34)式作双倒数处理，得：
=
（5-35)
(5-34)、(5-35)式为非竞争性抑制作用的动力学公式。当[S]为无限大时，(5-35)式简化成=
或V=
，即V恒小于Vmax。以[S]对V作图(图5-18a)，有I时的曲线低于无I时的曲线而不能相交。若以
对
作图(图5-18b)，可见有I时的直线的斜率和竞争性抑制一样，也为
，高于无I时的直线的斜率，有I时在纵轴上的截距为
，高于无I时的截距。说明有I时的最大速度随[I]增加而减小，称为表观Vmax(Vmaxapp)即Vmaxapp=
。但有I时在横轴上的截距仍为-
，和无I时的一样，即Km的数值不变，或Kmapp=Km。这是因为：当
=0时，
=
简化得Km·
=-1，故
=-
。
非竞争性抑制的动力学特点为：①当有I存在时，Km不变而Vmax减小，Km/Vmax增大。②Vmaxapp随[I]的加大而减小。③抑制程度只与[I]成正比，而与[S]无关。
图5-18非竞争性抑抑制动力学图
a.[S]对V作图 b. Lineweaver-Burk双倒数作图
3. 反竞争性抑制作用 反竞争性抑制(uncompetitiveinhitition)为抑制剂I不与游离酶E结合，却和ES中间复合体结合成EIS，但EIS不能释出产物。表示如下：
KS和Ki分别为ES及EIS的解离常数，当反应体系中加入I时，可使E+S和ES的平衡倾向ES的形成，因此I的存在反而增加S和E的亲和力。这种情况恰巧和竞争性抑制剂相反，故称为反竞争性抑制。根据平衡学说推导如下：
[ES]=[E][S] / KS (5-36)
[EIS]=[ES][I] / Ki=[E][S][I]/ KSKi (5-37)
[E0]=[E]+[ES]+[EIS] (5-38)
将以上各式代入(5-24)式=
，再经推导后，得到下式：
V= (5-39)
用Lineweaver-Burk法将(5-39)式作双倒数处理，可得：
·
(5-40)
(5-39)、(5-40)式是反竞争性抑制作用的反应速度公式。当[S]为无限大时，(5-40)式简化为，故和非竞争性抑制相似，V也恒小于Vmax。以[S]对V作图(图5-19a)，有I时的曲线低于无I时的曲线而不能相交。若以
对
作图(图5-19b)，可见有I时直线斜率与无I时相同，呈平行，斜率均为
。有I时在纵轴上的截距为
，即
=
，数值随[I]的增加而减少。有I时在横轴上的截距为，
即
=
，可见Kmapp也随[I]增加而减少。
图5-19 反竞争性抑制动力学图
a. [S]对V作图 b. Lineweaber-Burk双倒数作图
反竞争性抑制的动力学特点为：①当I存在时，Km和Vmax都减小，而Km/Vmax不变。②有I时的Kmapp和Vmaxapp都随[I]的增加而减小。③抑制程度既与[I]成正比，也和[S]成正比。
兹将上述三类抑制作用的各种动力学参数列于表5-3。
表5-3 三类抑制作用的动力学比较
| 抑制 种类 | Lineweaver-Burk作图法 | 表观Vmax ( | 表观Km ( | |||
| 斜 率 | 纵轴截距 | 横轴截距 | 直线 交点 | |||
| 无 |
|
|
| Vmax | Km | |
| 竞争 性抑制作用 |
（增大) |
（不变) |
（减小) | 纵轴 | Vmax （不变) | Km （增大) |
| 非竞 争性抑制作用 |
（增大) |
（增大) |
（不变) | 横轴 |
（减小) | Km （不变) |
| 反竞 争性抑制作用 |
（不变) |
（增大) |
（增大) | 无交点 平行 |
（减小) |
（减小) |
(三) 过渡态类似物与自杀底物
Linus Pauling首先提出某种类似于一个酶促反应中底物的过渡态的物质是酶的有效抑制剂，这种物质称为过渡态类似物。如吡咯-2-羧酸酯是微生物脯氨酸外消旋酶的有效抑制剂，它能像脯氨酸那样紧紧地与外消旋酶结合，它的α-碳原子像脯氨酸的外消旋作用的过渡态一样形成三角型构型，也带有一个负电荷，比脯氨酸与外消旋酶的结合更紧，因此，吡咯-2-羧酸酯是脯氨酸发生外消旋酶促作用的一种过渡态类似物。在脯氨酸外消旋酶催化L-脯氨酸异构化为D-脯氨酸发生外消旋作用时需通过一个过渡态，在此过渡态中，脯氨酸的α-碳原子丢失一个质子而成为三角形构型(trigonal)，三个键都在一个平面上，α-碳原子带一个负电荷，此对称性负碳离子在一侧重新质子化，形成L-异构体，或在另一侧重新质子化形成D-异构体(图5-20)。吡咯-2-羧酸酯具有与脯氨酸过渡态相似的三角形结构，是脯氨酸外消旋酶的底物过渡态类似物，是脯氨酸外消旋酶的有效抑制剂。
图5-20 脯氨酸外消旋酶的催化作用
酶的自杀底物是一类酶的天然底物的衍生物或类似物，在它们的结构中含有一种化学活性基团，当酶把它们作为底物来结合时，其潜在的化学基团能被解开或激活，并与酶的活性部位发生共价结合，使结合物停留在某种状态，从而不能分解成产物，酶因而致“死”，此过程称为酶的自杀，这类底物称为自杀底物(suicide substrate)。每一种自杀底物都有其专一作用的靶酶，因此自杀底物是专一性很高的不可逆抑制剂或失活剂。
如以E及SS分别代表酶与自杀底物，IS为自杀底物被酶催化生成的抑制物，则：
式中KS为E SS解离常数；Kcat为ESS转变为EIS的催化常数；Ki为E及IS形成结合物的速率常数。抑制效率及专一性不但与KS有关，更重要的是取决于Kcat；因而SS与E结合还不能成为抑制物，只有生成IS后才有抑制作用，故Kcat愈大，抑制作用也愈强，所以自杀底物也称Kcat型抑制剂。自杀底物与天然底物一样对人体无毒或毒性较少，因此有重要药用价值。
第五节 酶的分离、提纯及活性测定
一、 酶的分离、提纯
生物细胞产生的酶有两类，一类由细胞内产生后分泌到细胞外发挥作用的酶，称为细胞外酶；这类酶大都是水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶就是由胃粘膜细胞和胰腺细胞所分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到。另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶；这类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行；如氧化还原酶在线粒体上，蛋白质合成的酶存在于微粒体上。
酶来源于动物、植物和微生物。生物细胞内产生的总酶量是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰腺中起消化作用的水解酶种类虽多，但各种酶的含量却差别很大，如1000g湿胰腺中含胰蛋白酶0.65g而含DNA酶仅有0.0005g。因此，在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。由于从动物或植物中提取酶制剂会受到原料限制，目前工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量的酶制剂。
由于在生物组织细胞中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其他酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时必须经过分离和纯化的手续。
酶是蛋白质，故蛋白质分离纯化的方法也是分离、纯化酶的常用方法。蛋白质很易变性，所以在酶提纯过程中，应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶是具有催化活性的蛋白质，通过测定催化活性，可以比较容易地追踪酶在分离提纯过程中的去向，酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收多少酶、纯度提高了多少，从而决定这一步骤的取舍。
(一) 酶的抽提
1. 破碎细胞膜 对细胞外酶只要用水或缓冲液浸泡，滤去不溶物，就可得到粗抽提液。对于细胞内酶，则必须先使细胞膜破裂后才能释放出来。动物细胞较易破碎，通过一般的研磨器、匀浆器、捣碎机等就可达到目的。细菌细胞具有较厚的细胞壁，较难破碎，需要用超声波、溶菌酶、某些化学溶剂(如甲苯、去氧胆酸钠)在适宜的pH和温度下保温一定时间，使菌体自溶液化或冻融等处理加以破碎。
2. 抽提 由于大多数酶属于清蛋白或球蛋白类，因此一般的酶都可以用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。抽提液和抽提条件的选择取决于酶的溶解度、稳定性等。
抽提液的pH选择应该在酶的pH稳定范围内，并且最好能远离其等电点。关于盐的选择，由于大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中较易溶解，故一般用等渗盐溶液，最常用的有0.02～0.05mol/L磷酸缓冲液、0.15mol/L氯化钠和柠檬酸缓冲液等。抽提温度通常都控制在0～4℃。
(二) 纯化
抽提液中除了含有所需要的酶以外，还杂有其他小分子和大分子物质。小分子物质在纯化过程中会自然地除去，大分子物质包括核酸、粘多糖和杂蛋白等往往干扰纯化。核酸一般可用鱼精蛋白或氯化锰使之沉淀去除，粘多糖可用醋酸铅处理，剩下的就是杂蛋白，因此纯化的主要工作就是将酶从杂蛋白中分离出来。
分离纯化的方法很多，常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法及吸附分离法等。
根据酶和杂蛋白带电性质的差异进行分离的方法有离子交换法和电泳法，前者用于大体积制备，应用很广，分辨力也高，电泳法主要作为分析鉴定的工具或用于少量分离。
选择性变性法在酶的纯化工作中是常用的简便而有效的方法。主要是根据酶和杂蛋白在某些条件下热稳定性的差别，使某些杂蛋白变性而达到除去大量杂蛋白的目的，常用的除选择性热变性外、还有酸碱变性等。有些酶相当耐热，如胰蛋白酶、RNA酶加热到90℃也不破坏，因此在一定条件下将酶液迅速升温到一定温度(50～70℃)，经一定时间后(5～15分钟)迅速冷却，可使大多数杂蛋白变性沉淀，应用得当，酶纯度可得到提高。
酶是生物催化剂，在提纯时必须尽量减少酶活力的损失，因此全部操作需在低温下进行。一般在0～5℃之间进行，用有机溶剂分级分离时必须在零下15℃进行。为防止重金属使酶失活，有时需在抽提溶剂中加入少量EDTA螯合剂，有时为了防止酶蛋白中的巯基被氧化失活，需要在抽提溶剂中加少量巯基乙醇。在整个分离提纯过程中不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，而使酶变性。
为了达到比较理想的纯化结果，往往需要几种方法配合使用，主要根据酶本身的性质来决定所选择的方法。
提纯的目的，不仅在于得到一定量的酶，而且要求得到不含或尽量少含其他杂蛋白的酶制品。在纯化过程中，除了要测定一定体积或一定重量的制剂中含有多少活力单位外，还要测定酶制剂的纯度。酶的纯度用比活力表示，比活力即每毫克蛋白(或每毫克蛋白氮)所含的酶活力单位数。
比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白(氮)
在酶的纯化工作中还要计算纯化倍数和产率%(即回收率)。
纯化倍数= 产率%=
%
一个酶的纯化过程，常常需要经过多个步骤，若每一步平均使酶纯度增加1～2倍，总纯度可高达数百倍，但产率约为百分之几到十几。兹以天冬酰胺酶纯化过程为例说明于表5-4。
表5-4 从E.coli中分离纯化天冬酰胺酶
| 纯化 步骤 | 总蛋 白mg | 总活力 I.U. | 比活力 I.U./mg | 回收 率% | 纯化 倍数 | 纯化 步骤 | 总蛋白 mg | 总活力 I.U. | 比活力 I.U./mg | 回收 率% | 纯化 倍数 | |
| 匀浆液 | 1.4×106 | 2.8×106 | 2 | 100 | 1 | DEAE柱色谱 | 8×103 | 1×106 | 125 | 36 | 62.5 | |
| 等电点沉淀 | 4×104 | 1.4×106 | 35 | 50 | 17.5 | CM柱色谱 | 5×103 | 9×105 | 180 | 32 | 90 | |
由上表可见通过4个主要步骤，总蛋白逐渐减少，总活力也减少，但相比起来杂蛋白去除更多，而酶除去较少，因此纯度提高，比活力由2.0上升到180，纯化倍数为90倍。但酶在纯化时也损失不少，原来总活力为2.8×106，最后为9×105回收率为32%。
二、 酶的活力测定
酶的活力测定，实则是酶的定量测定。检查酶的含量及存在，不能直接用重量或体积来表示，而用酶的活力来表示，酶活力的高低是研究酶的特性，进行酶的生产及应用时的一项必不可少的指标。
活力就是酶催化一定化学反应的能力。酶的活力大小，可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。酶催化的反应速度愈大，则酶的活力也愈大。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速度。
按米氏公式可知反应初速度与酶浓度成正比，即V=K"[E0]。这是定量测定酶浓度的理论基础，酶反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，通常测定产物的增加量，所以反应速度的单位是：浓度/单位时间。
在实验中必须确保所测定的是初速度，即底物消耗的百分比很低，此时产物浓度—时间(p-t)呈直线关系(如图5-20)。否则，由于底物的消耗，反应速度变慢或者由于产物的积累产生的逆反应明显地影响正向反应速度，使得p-t作图逐渐偏离直线。所以测定酶浓度首先要确定p-t的直线范围。在酶催化反应中如果其他条件选择好后，决定p-t关系的主要因素是底物浓度，酶浓度和反应时间。一般采用高底物浓度[S]≥100Km(零级反应)测定反应初速以定量酶浓度。
图5-20 当[S0]≥100Km，在不同的酶浓度下产物形成量与时间的关系
酶活力的高低以酶活力单位(U)表示。酶活力单位的含义是指酶在最适条件下，单位时间内，酶催化底物的减少量或产物的生成量，1961年国际酶学会议规定：1个酶活力国际单位(InternationalUnit)指在特定条件下，1分钟内生成1微摩尔(1μmol/L)产物的酶量(或转化1个微摩尔底物的酶量)。1972年国际酶学委员会又推荐一个新的酶活力国际单位，即Katal(Kat)单位，1Kat单位定义为“在最适条件下，每秒钟可使1摩尔(1mol/L)底物转化的酶量。”1Kat=6×107IU。
在实验室和生产上还常用习惯单位表示酶活力，如用每小时催化1ml 2%可溶性淀粉液化所需要的酶量，作为α-淀粉酶的1个活力单位，又如α-糜蛋白酶在37℃，pH7.5作用于酪蛋白，在测定条件下，每分钟产生相当1微克酪氨酸所需要的酶量称为一个活力单位。酶的习惯活力单位使用方便，已广泛采用，但表示方法不够严格，同一种酶常用多种不同酶单位表示，不便于对酶活力进行比较。
酶的转换数Kcat 酶的转换数(turnover number)是指单位时间，每一个催化中心所转换的底物分子数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数(μmol)，因为Vmax=K3[Et]，故转换数可表示如下：
转换数(Kcat)=K3=
所以在数值上，Kcat=K3是由ES形成产物的速度常数。如1个分子碳酸酐酶，每秒钟催化0.6mol碳酸产生，则其Kcat=6×105/S(μmol/秒)。
第六节 重要的酶类
一、 寡聚酶
寡聚酶(oligomeric enzyme)的分子量为35000至几百分以上，它们含有2个以上的亚基，多的可含60个亚基，巧妙地结合成具有催化活性的酶。寡聚酶可分为含有相同亚基的寡聚酶和含有不同亚基的寡聚酶两大类。
1. 含相同亚基的寡聚酶 许多参与体内物质代谢的酶不是简单的单体蛋白质而是由不同数目亚基所组成的寡聚蛋白质，而且它们所含的亚基的一级结构都是相同的。现已证实单体酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶)为数不多，而寡聚酶则是普遍地存在。如鼠肝苹果酸脱氢酶含2个亚基，酵母己糖激酶含4个亚基，大肠杆菌谷氨酰胺合成酶含12个亚基。
2. 含不同亚基的寡聚酶
(1) 双功能寡聚酶：色氨酸合成酶是由两分子蛋白A和一分子蛋白B所构成的。蛋白A的分子量为29500，含一个α亚基；蛋白B的分子量为90000，含两个β亚基。蛋白A和蛋白B有不同的催化功能，可以分别催化下列反应：
当蛋白A和蛋白B结合而成色氨酸合成酶时，可以催化下列反应：
反应(3)是反应(1)和反应(2)偶联的总反应。通过蛋白A和蛋白B的相互作用，不仅可以使反应(1)和反应(2)紧密地偶联起来，而且还可以使每个蛋白的酶活性提高30～100倍。同时中间产物—吲哚，并不从酶复合物释放出来。因此，这个酶只有当它的两种功能性亚基以复合物形式存在，联合起作用时，才能完成色氨酸的合成。
(2) 含有底物载体亚基的寡聚酶 大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶，由三个蛋白质部分组成：两个具有催化活性的蛋白质—生物素羧化酶及转酰基酶，一个具有专一性的生物素羧基载体蛋白亚基(BCCP)。这个载体亚基专一性地运载底物CO2。这三部分联结起来催化的反应分两步进行。
3. 寡聚酶的意义 由于寡聚酶的多重亚基结构，所以在机体代谢活动中具有重要作用。如某些酶反应必须由具有不同酶功能的亚基互相连接，协调配合，才能完成。在某些酶反应中，又必须有起底物载体作用的亚基，才能专一性地运载底物，使底物受到具有酶活性的蛋白部分的催化而生成产物。
含有亚基的酶分子的聚合与解聚是代谢调节的重要方式之一。由于酶与一些调节因子的结合会引起酶的聚合和解聚，实现酶的活性与无活性态间的相互转化。如谷氨酸脱氢酶含6个亚基，每3个亚基构成一个三面体，6个亚基连成一个双层三面体，前者为y型，催化谷氨酸脱氢，后者为x型对谷氨酸的脱氢活力下降，主要催化丙氨酸脱氢，若三面体层数进一步增加形成多聚体、呈长纤维状，则无酶活性。
二、 同工酶
同工酶(isoenzyme)是指能催化相同的化学反应，但分子结构不同的一类酶，它不仅存在于同一机体的不同组织中，也存在于同一细胞的不同亚细胞结构中，它们在生理上、免疫上、理化性质上都存在很多差异。
同工酶是由两个以上的亚基聚合而成，其分子结构的不同处主要是所含亚基组合情况不同，在非活性中心部分组成不同，但它们与酶活性有关的结构部分均相同，已发现的同工酶有数百种。
其中研究最多的是乳酸脱氢酶(LDH)。存在于哺乳动物中有五种乳酸脱氢酶同工酶，它们都催化同样的反应：
乳酸 丙酮酸
它们的分子量都相近，大约为140 000，由四个亚基组成，每个亚基分子量约35 000。四个亚基有两种类型，分别叫做H亚基和M亚基。五种同工酶的亚基组成分别为HHHH(心肌中以此为主)、HHHM、HHMM、HMMM及MMMM(骨骼肌中以此为主)。在五种不同形式的LDH中，H4叫作LDH-1(或LDH-A)，H3M叫作LDH-2，H2M2叫作LDH-3，HM3叫做LDH-4，M4叫做LDH-5(或LDH-B)。两种类型亚基在许多方面有所差别，最重要的差别是氨基酸组成及Km等动力学性质不同。因氨基酸组成不同，则带电情况不同，所以可用电泳法把不同类型的LDH分开，电泳图谱见图5-21。两种类型亚基对底物的米氏常数显著不同。骨骼肌LDH对底物丙酮酸的Km值高，因此，当丙酮酸浓度增加时，酶反应速度增大。而心肌LDH对丙酮酸底物的Km值低，丙酮酸浓度增大时，酶很快饱和，反应速度不能随着底物浓度的增加而增大，而且在高浓度丙酮酸时活力被抑制。这样，肌肉中LDH-5多，而心、脑中LDH-1多。肌肉中可产生大量的乳酸，心、脑则相反，在高浓度丙酮酸条件下，丙酮酸不能转变为乳酸、被迫进入三羧酸循环，氧化供给能量(见糖代谢章)。说明不同器官存在的同工酶与各器官的代谢环境相适应，起着不同的生理功能。
近年来同工酶的研究已应用于疾病的诊断。正常情况下，血清中LDH活力很低，多半由红细胞渗出的。当某一器官或组织病变时，LDH同工酶释放到血液中，血清的LDH同工酶电泳图谱就会发生一定变化。例如冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损患者血清中LDH1与LDH2含量增高，而肝细胞受损患者血清中LDH5增高。
图5-21 LDH同工酶电泳图
三、 诱导酶
诱导酶(induced enzyme)是指当细胞中加入特定诱导物质而诱导产生的酶。它的含量在诱导物存在下显著增高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。诱导酶在微生物中较多见。例如大肠杆菌平时一般只利用葡萄糖，当培养基不含葡萄糖，而且只含乳糖时，开始代谢强度非常低，继续培养一段时间后，代谢强度慢慢提高，最后达到与含葡萄糖时一样，因为这时大肠杆菌中已产生了属于诱导酶的半乳糖苷酶。
许多药物能加强体内药物代谢酶的合成，因而能加速其本身或其他药物的代谢转化。研究药物代谢酶的诱导生成对于阐明许多药物的耐药性是重要的。如长期服用苯巴比妥催眠药的人，会因药物代谢酶的诱导生成而使苯巴比妥逐渐失效。有关诱导物能诱导产生酶的机制见“代谢调节”章。
四、 调节酶
调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应的功能。调节酶一般可分为共价调节酶(covalent regulatory enzyme)及变构酶(allosteric enzyme)两类。
(一) 共价调节酶
这是指调节剂通过共价键与酶分子结合，以增、减酶分子上的基团从而调节酶的活性状态与非活性状态的相互转化。如动物组织中的糖原磷酸化酶即为典型的共价调节酶。糖原磷酸化酶有活力强的磷酸化酶a与活力弱的磷酸化酶b两种形式，前者多肽链上丝氨酸残基的—OH与磷酸基共价连接形成具有最大活力的磷酸化酶a，而磷酸化酶磷酸酶能水解去掉磷酸基使磷酸化酶a转变为活力低的磷酸化酶b。
磷酸化酶b经磷酸化酶激酶催化又可同ATP作用转变为磷酸化酶a。
通过酶分子的磷酸基共价修饰与去除，使磷酸化酶的活力得到调节。迄今已发现有100多种酶在其被翻译后要进行化学修饰、以调节酶活力。主要化学修饰类型有6种：①磷酸化/去磷酸化，②乙酰化/去乙酰化，③腺苷酰化/去腺苷酰化，④尿苷酰化/去尿苷酰化，⑤甲基化/去甲基化，⑥S—S/—SH。
(二) 变构酶
变构酶又名别构酶，迄今已知的变构酶都是寡聚酶，它含有两个以上的亚基。分子中除了有可以结合底物的活性中心外，还有可以结合调节物(或称效应剂)的变构中心。这两个中心可位于不同的亚基上也可位于同一个亚基的不同部位上。变构酶的活性中心与底物结合，起催化作用。而变构中心则调节酶反应速度。
调节物与酶分子中的变构中心结合引起酶蛋白构象的变化，使酶活性中心对底物的结合与催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度，此效应称为酶的变构效应。如酶产生变构效应后，导致酶的激活即称为变构激活作用，反之就称为变构抑制作用。并分别将导致变构激活及变构抑制作用的调节物称为变构激活剂及变构抑制剂。
协同效应也是多亚基变构酶的一个特征。所谓协同效应是指当一个配体(调节物分子或底物分子)与酶蛋白结合后，可以影响另一配体和酶的结合，根据这个影响是促进还是减慢以及第二个结合的配体和第一个配体是否相同可把协同效应分为以下几类：
1. 同种效应和异种效应 同种效应就是一分子的配体结合在蛋白质的一个部位影响另一分子的同样配体在另一部位的结合。异种效应是一分子的配体在一部位的结合会影响另一分子的不同配体在另一部位的结合。
2. 正协同效应和负协同效应 正协同效应或正协同性是指1分子配体与蛋白质结合后，可促进下一分子配体的结合。或者说当1分子配体与酶蛋白的1个催化部位或调节部位结合后，分别可使另一催化部位(一般在不同亚基上)或调节部位(也在不同亚基上)对配体的亲和力增高，即酶愈饱和，对配体的结合愈容易。反之，负协同效应或负协同性是指1分子配体与蛋白质或酶结合后，可使蛋白质或酶对下一分子配体的亲和力降低，即酶愈饱和，对配体的结合愈困难。如1分子O2与Hb的1个亚基结合后，可促进另1分子O2结合在Hb的另一亚基上，或者1分子底物和酶的1个亚基结合后，可促进1分子底物与酶的另一亚基结合，这就是同种正协同效应。同种效应一般都是正协同效应，但也有例外。而异种效应可以是正协同性也可以是负协同性。如变构激活剂可增加底物和酶的亲和力，是一种异种正执业护士网协同效应，而变构抑制剂可减少底物和酶的亲和力，是一种异种负协同效应。但一个变构抑制剂与酶结合后，也可促进下一分子抑制剂与酶结合，这样对抑制剂本身说来，又是同种正协同效应。
大部分变构酶的初速度—底物浓度的关系不符合典型的米氏公式，即不呈一般的V-[S]双曲线，许多变构酶尤其是同种效应变构酶类，其初速-底物浓度关系是显示S形曲线(见图5-22(2))。
这种S形曲线表明酶结合了1分子底物(或调节物)后，酶的构象发生了变化，这种新的构象大大地有利于以后的分子与酶结合，这种变构酶称为具有正协同效应的变构酶。
变构酶的S形动力学关系，非常有利于对反应速度的调节。现将变构酶的S形曲线与非调节酶的曲线表示于图5-22中，从图可看出，在非调节酶曲线中，当[S]=0.11 时，V达到Vmax的10%，当[S]=9时，V达到Vmax的90%，达到这两种速度的底物浓度之比为81；而在S形曲线中，达到同样两种速度的底物浓度比仅为3
。这表明当底物浓度略有变化时，如[S]上升3倍，变构酶的酶促反应速度可从10%Vmax突然上升到90%Vmax，而在典型的米氏类型的酶中，速度若发生同样的变化，则要求底物浓度上升81倍才行。这就说明对于变构酶来说，酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。因此在完整细胞中，在较低的底物浓度下这种S形反应就体现为当底物浓度发生较小的变化时，变构酶可以极大程度地控制着反应速度，这就是变构酶可以灵敏地调节酶反应速度的原因所在。
另一类为具有负协同效应的变构酶，这类酶的动力学曲线与双曲线有些相似(见图5-23(2))，故也被称为表观双曲线。它表示随着底物浓度的增高，曲线的斜率愈来愈低，即速度的增加愈来愈小，也就是说负协同效应可使酶的反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感。
图5-22 底物浓度对两种催化反应速度的影响 图5-23 负协同变构酶与非调节酶动力学曲线
（1)非调节酶的曲线；（2)变构酶的S形曲线 （1)非调节酶的曲线；（2)负协同变构酶的曲线
第七节 酶在医药学上的应用
一、 酶在疾病诊断上的应用
血清中有很多酶，是血清蛋白的重要组成部分，来自血细胞和各种组织。除少数血清酶在血中发挥重要催化功能外，大多数血清酶的活性很低。但当体内某些器官或组织发生病变时，往往会影响一些血清酶的活性，因此，测定血清酶活力在疾病诊断上具有重要意义。
血清酶活力测定已广泛用于诊断肝胆疾病、心肌梗塞、肿瘤、骨骼疾病等。
(一) 血清酶测定应用于肝胆疾病的诊断
当肝脏病变时，可引起血清中很多酶活力的变化，主要有：
1. 转氨酶 包括血清谷草转氨酶(SGOT)与血清谷丙转氨酶(SGPT)，血清转氨酶是急性黄疸型肝炎前期最早出现的异常指标，因为它是肝细胞损伤最敏感的指标之一。
2. 卵磷脂-胆固醇转酰基酶(LCAT) 该酶由肝脏合成而分泌入血，催化卵磷脂和游离胆固醇之间的转脂肪酰基作用而生成溶血卵磷脂及胆固醇酯(见脂类代谢章)。在肝病时，血清中的酶活力降低。
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（GSH)
活动性肝病患者血清中γ-GT升高，故γ-GT是活动性肝病的诊断指标。
(二) 血清酶的测定应用于急性心肌梗塞的诊断
应用于心肌梗塞的血清酶主要有血清谷草转氨酶(SGOT)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)，其中LDH与CK具有较高阳性率与特异性。
1. LDH同工酶 LDH1在心肌中含量最高，心肌梗塞时，释放LDH1明显高于其他同工酶，因而患者血清中LDH1/LDH2比值明显升高。
2. CK同工酶 CK-MB(M及B表示亚基)同工酶是诊断心肌梗塞的最好指标，心肌梗塞时，血清中CK-MB可增高6倍。
(三) 血清酶的测定应用于诊断肿瘤
1. γ-GT γ-GT可作为活动性肝病的指标，它对肝癌的诊断也有一定意义。实验证明：原发性或继发性肝癌时，血清γ-GT均见升高。
2. 半乳糖基转移酶(Gal T)同工酶 该酶有Ⅰ、Ⅱ两种同工酶。正常人血清中只有Gal T-Ⅰ，而癌症患者血清中的GalT-Ⅰ虽仅略高于正常，但可出现Gal T-Ⅱ，阳性率为73%～83%。所以Gal T-Ⅱ是一个较好的癌症诊断指标。
二、 酶在治疗上的应用
用于治疗疾病的酶类药物主要有以下几类：
1. 助消化酶 该类药物中有胃蛋白酶、胰酶、纤维素酶及淀粉酶等。
2. 消炎酶 有胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、溶菌酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胶原蛋白酶、黑曲霉蛋白酶等。这些酶能水解炎症部位纤维蛋白及脓液中粘蛋白，适用于消炎、消肿、消疮、排脓与促进伤口愈合。
3. 防治冠心病用酶 胰弹性蛋白酶具有β脂蛋白酶的作用，能降低血脂、防治动脉粥样硬化。激肽释放酶(血管舒缓素)有舒张血管作用、临床用于治疗高血压和动脉粥样硬化。
4. 止血酶和抗血栓酶 止血酶有凝血酶和凝血酶致活酶。抗血栓酶有纤溶酶、葡激酶、尿激酶与链激酶，但后两者的作用是使无活性的纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，使血液中纤维蛋白溶解，防止血栓形成。
蛇毒降纤酶，蚓激酶、组织纤溶酶原激活剂(tPA)也是近期研究成功的有效抗栓剂。
5. 抗肿瘤酶类 L-天冬酰胺酶能水解破坏肿瘤细胞生长所需的L-天冬酰胺，临床上用于治疗淋巴肉瘤和白血病。谷氨酰胺酶也有类似作用。
6. 其他酶类药物 细胞色素C是呼吸链电子传递体可用于治疗组织缺氧。超氧化物歧化酶用于治疗类风湿性关节炎和放射病。青霉素酶治疗青霉素过敏。透明质酸酶用于药物扩散剂并治疗青光眼。
三、 固定化酶及其在医药上的应用
(一) 固定化酶的概念和优点
固定化酶(immobilized enzyme)是借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并仍具有催化活性的酶制剂。是近代酶工程技术的主要研究领域。
酶在水溶液中不稳定，一般不便反复使用，也不易与产物分离，不利于产品的纯化。固定化酶可以弥补这些缺点，它在催化反应中具有许多优点：①酶经固定化后，稳定性有了提高；②可反复使用，提高了使用效率、降低了成本；③有一定机械强度，可进行柱式反应或分批反应，使反应连续化、自动化，适合于现代化规模的工业生产；④极易和产物分离，酶不混入产物中，简化了产品的纯化工艺。
(二) 固定化酶的制备方法
1. 吸附法 使酶分子吸附于水不溶性的载体 上，有物理吸附法及离子交换剂吸附法。用于物理吸附法的载体有高岭土、磷酸钙凝胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、胶原、淀粉等。用于离子吸附法的载体有CM-纤维素、DEAE-纤维素和DEAE-Sephadex，合成的大孔阳离子和阴离子交换树脂等。
2. 共价结合法 将酶通过化学反应以共价键结合于载体的固定化方法。本法是固定化酶研究中最活跃的一大类方法。以重氮法举例如下：
3. 交联法 它是用多功能试剂与酶蛋白分子进行交联的一种方法。基本原理为酶分子中游离氨基、酚基及咪唑基均可和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网状结构，如戊二醛和酶蛋白的交联如下：
4. 包埋法 是将酶物理包埋在高聚物内的方法。可将酶包埋在凝胶格子中或半透膜微型胶囊中。
(三) 固定化酶在医药上的应用
固定化酶在工业、医学、分析工作及基础研究等方面有广泛用途。现仅着重介绍与医药有关的几方面。
1. 药物生产中的应用 医药工业是固定化酶用得比较成功的一个领域，并已显示巨大的优越性。如酶法水解RNA制取5"-核苷酸，5"-磷酸二酯酶制成固定化酶用于水解RNA制备5"-核苷酸，比用液相酶提高效果15倍。此外，青霉素酰化酶、谷氨酸脱羧酶，延胡索酸酶、L-天冬氨酸酶、L-天冬氨酸β-脱羧酶等都已制成固定化酶用于药物生产。
2. 亲和层析中的应用 亲和层析是利用生物大分子能与其相应的专一分子可逆结合的特性而发展的一种层析方法。如抗体和抗原、酶和底物或抑制剂、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸间都存在专一的亲和力，若将其一方固定化在载体上，就可根据它们间的专一结合力而将被分离的大分子物质吸附于载体上，洗去杂质后再将它解离，就可得到纯的物质。
3. 医疗上的应用 制造新型的人工肾，这种人工肾是由微胶囊的脲酶和微胶囊的离子交换树脂的吸附剂组成。前者水解尿素产生氨，后者吸附除去产生的氨，以降低病人血液中过高的非蛋白氮。
(吴梧桐)
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