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1 材料和方法
1.1 材料
wistar大鼠(武汉大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体质量150 g左右。实验试剂:胰蛋白酶(Gibco),谷氨酰胺(武汉天源生物技术有限公司)，胎牛血清(Gibco),DMEM干粉培养基(Hyclone)。
1.2 鼠尾胶原的制作实验所用胶原溶液为酸溶性鼠尾腱胶原。将wistar大鼠的尾部剪下，浸入75%的乙醇中消毒30 min，在无菌条件下将鼠尾腱抽出剪碎，置于5 g/L乙酸中，4 ℃条件下持续搅拌，48 h后低温离心去渣(10 000 r/min,30 min)，收集上清液。
1.3 BMSC培养按文献[1]取材。4~5周龄肝素化wistar大鼠断颈处死,无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，在含2%胎牛血清完全培养基的玻璃平皿中，去除股骨周围组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，抽取5 mL含2%胎牛血清的完全培养基冲洗骨髓腔，离心获得骨髓细胞团，再用15%胎牛血清完全培养基将细胞团重悬为单细胞悬液，接种于玻璃培养瓶中(37 ℃，5%CO2，饱和湿度)培养，于24 h后半量换液。此后每隔2~3 d换液一次，以弃去未贴壁细胞。细胞长至70%~80%融合时传代。
1.4 BMSC胶原网架制作取第二代对数生长期细胞胰酶消化后，用胎牛血清制成单细胞悬液，细胞含量为2×108/L。细胞悬液∶10×DMEM∶胶原溶液按1∶12∶120的容积比例，置冰上充分混匀，用1 mol/L的氢氧化钠中和至PH值为中性。取100 μL加入一个24孔板中(板底铺多聚赖氨酸包被过的玻片)，37 ℃，5%CO2培养箱中放置10 min，待培养板中形成半固体凝胶后，加入1 mL完全培养基，于培养箱中继续孵育培养，2~3 d换液一次。培养15 d共聚焦显微镜下观察细胞生长形态特点。
1.5 MTT法绘制细胞生长曲线按上述方法制备BMSC胶原混悬液，将混悬液滴于24孔板中，每孔0.2 mL，置于培养箱中10 min以形成半固体凝胶。加入1 mL完全培养基于培养箱中培养，2~3 d换液1次。从培养第2天起，每次取3孔，用5 g/L胶原酶消化，制备单细胞悬液。将单细胞悬液加入180 μL新鲜DMEM完全培养基和20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，离心后弃去培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)80 r/min振摇10 min，充分溶解，酶标仪上读取570 nm处的A值，取3孔的平均值作为增殖变化指标。连续13 d检测细胞增殖，绘制生长曲线。
1.6 ALP钙钴染色、苏丹Ⅲ染色培养第15天，取出细胞爬片，10%甲醛固定，0.1%Triton破膜，分别行ALP钙钴染色(入2%硝酸钴水溶液及1%硫化铵水溶液染色)、苏丹Ⅲ染色(入苏丹Ⅲ染液中孵育)，显微镜下随即选择15个不重叠视野，统计阳性染色细胞率(阳性细胞数/计数细胞总数×100%)。
2 结果
2.1 BMSC形态特征连续15 d观察发现，24 h后细胞已开始伸展呈长梭形，但在前1周内，BMSC呈现集落生长趋势，绝大部分细胞以长梭形为主，随着时间延长，近似圆形、扁形、三角形细胞逐渐增多，且细胞之间伸出突触互相连接，交织成网状结构(见图1)医.学.全.在.线www.med126.com。
2.2 BMSC生长特征在15 d内，BMSC细胞数目逐渐增多，细胞体积逐渐增大，整个过程呈现出逐渐生长趋势，且第4~10天为细胞生长高峰期，到达11 d左右细胞生长基本静止(见图2)。
图2 三维培养中BMSC生长曲线(略)
2.3 BMSC向成骨细胞及脂肪细胞分化能力培养至7 d后，可见细胞形态逐渐多样化，其中以圆形或梭形多突起细胞(近似骨细胞形态)为主，该类细胞钙钴染色为阳性;细胞形态相对较大的圆形或椭圆形空泡状细胞，苏丹Ⅲ染色为阳性。钙钴染色阳性率高于苏丹Ⅲ染色细胞阳性率(见图3~4)。
