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1 材料与方法
1.1 动物与分组
成年SPF级雄性SD大鼠(250 ～ 300 g)，由中山大学实验动物中心提供。大鼠随机分为16组(n = 6)：对照组(生理盐水)、鞘内七叶皂苷组(5、10、20、40 μg)、鞘内可乐定组(1、2、5、10 μg)、鞘内混合药物组为1/2、1/4、1/8、1/16(七叶皂苷ED50 + 可乐定ED50)、鞘内拮抗组(育亨宾20 μg + 可乐定10 μg、育亨宾20 μg + 七叶皂苷20 μg、育亨宾20 μg + 七叶皂苷1/2 ED50 + 可乐定1/2 ED50)。ED50是指能使甲醛炎症痛模型大鼠疼痛反应较对照组减少50%时的药物剂量。
实验用药：七叶皂苷(Escin)、可乐定(Clonidine)、育亨宾(Yohimbine)和利多卡因(Lidocaine)均为美国Sigma公司产品医.学.全.在.线www.med126.com。
1.2 蛛网膜下腔置管
采用Zeng等[4]的方法进行大鼠蛛网膜下腔置管。处死置管后出现运动障碍者，管内注射20 g/L利多卡因(10 μL)，30 s内出现双后肢麻痹则说明导管位置正确。剔除导管位置不正确者，待大鼠恢复4 ～ 5 d后，再进行下一步实验。
1.3 蛛网膜下腔用药
所有用药均用生理盐水溶解成10 μL溶液，药物注射完后均用10 μL 生理盐水冲洗蛛网膜下腔导管。鞘内用药10 min后制作甲醛炎症痛模型并做行为学测试，完毕后再次判断导管位置是否正确(方法同前)。
1.4 运动功能评估
按下述方法对大鼠运动功能进行评估：0 = 自由活动无任何限制;1 = 活动受限或后肢运动不协调; 2 = 后肢无力支撑躯体但仍可活动或对疼痛刺激有反应; 3 = 后肢完全瘫痪。
1.5 甲醛炎症痛模型制作及行为学测试
按Yoon等[5]的方法，用1 mL注射器(25 G针头)将50 μL 20 mL/L甲醛溶液注射到大鼠右后足跖面皮下，剔除局部出血者。甲醛炎症痛表现为典型的双相性，一般认为：0 ～ 5 min为Ⅰ相，5 ～ 10 min 为间歇期，10 ～ 60 min为Ⅱ相。
参照文献[6]进行疼痛行为学评分：0分 = 大鼠行为正常，双后肢均承重;1分 = 大鼠被注射肢体轻触玻璃台面，轻微承重或不承重;2分 = 大鼠完全缩回被注射侧肢体;3分 = 舔、咬或抖动被注射侧肢体。以缩腿及舔爪 (即行为学评分 > 2) 作为退缩反应(Flinch)的标准，以0 ～ 10 min 为Ⅰ相，11 ～ 60 min为Ⅱ相，记录60 min内每5 min的退缩反应时间(s)。
1.6 数据处理及统计学分析
以每5 min的退缩反应时间绘制时间-反应曲线，用线性回归方法计算七叶皂苷和可乐定Ⅰ、Ⅱ相ED50及其95%置信区间(95% Confidence intervals，CI95)。为计算ED50，以实验组与对照组退缩反应时间比 × 100%作为抗伤害作用百分比(maximal possible effect， rMPE)， ED50即 rMPE = 50%时的药物剂量。 根据得到的两药的ED50进行混合组的实验，用线性回归的方法计算两药混合时各自的ED50及CI95。参照文献描述[7]的辐射分析法(Isobolograms)对七叶皂苷和可乐定的相互作用进行评价。将可乐定和七叶皂苷的ED50及其CI95分别标注于x轴和y轴上，连接两药ED50而成的直线就是两药混合作用时的理论相加线。同时，在图中标示出混合组两种药物各自的ED50及其CI95。假设两药混合使用仅有相加作用，按文献[8]的方法计算理论上两药各自的ED50，标注于理论相加线上。数据以均数 ± 标准误(x ± sx)表示，组间对比采用SPSS 13.0进行单因素方差分析，七叶皂苷-可乐定混合用药组理论ED50和实验ED50比较采用t检验。P < 0.05认为有统计学差异。
2 结 果
2.1 七叶皂苷抗炎症痛作用
两组大鼠用药后均未发现运动功能异常。注射甲醛溶液后，大鼠立即出现疼痛反应，表现为抬高、舔咬注射足，可观察到完整的双相疼痛反应。鞘内注射七叶皂苷5、10、20、40 μg对甲醛炎症痛Ⅰ相无明显抑制作用;鞘内注射5、10 μg七叶皂苷对Ⅱ相痛有微弱抑制作用，但无统计学意义;而注射20、40 μg时则产生了明显抗炎症痛作用(P<0.01)，其峰值出现在40 min左右，且呈明显的剂量依赖性(图1)，其ED50为16.71 μg(CI95为11.06 ～ 22.36 μg)。
2.2 可乐定抗炎症痛效应
鞘内可乐定1 μg对甲醛炎症痛Ⅰ、Ⅱ相有微弱抑制作用，但无统计学意义;鞘内可乐定2 μg对Ⅱ相痛有一定抑制作用(P < 0.05);剂量达5 μg 和10 μg时对Ⅰ、Ⅱ相疼痛均有明显抑制作用(P < 0.01)，其峰值在40 min左右，且有明显的剂量依赖性(图2)，其I相ED50为4.17 μg(CI95为0.05 ～ 5.29 μg)，Ⅱ相ED50为2.58 μg(CI95为0.51 ～ 3.64 μg)。
2.3 混合给药抗炎症痛作用
鞘内混合给药1/16 ED50组(七叶皂苷1 μg +可乐定 0.2 μg)和1/8 ED50组(鞘内七叶皂苷2 μg +可乐定 0.4 μg)组对Ⅰ、Ⅱ相痛均无明显抑制作用;鞘内1/4 ED50组(七叶皂苷4.2 μg +可乐定 0.7 μg)对Ⅱ痛有抑制作用(P < 0.01)，但对Ⅰ相痛无作用;鞘内1/2 ED50组(七叶皂苷8.4 μg + 可乐定 1.3 μg)对Ⅰ、Ⅱ相痛均有明显的抑制作用(P < 0.05和P < 0.01)，其峰值出现在35 min左右(图3)，两种药物合用对Ⅱ相痛抑制作用的实验ED50分别为：七叶皂苷3.17 μg (CI95 2.17 ～ 4.18 μg)、可乐定0.49 μg (CI95 0.34 ～ 0.65 μg);理论(相加作用) ED50为：七叶皂苷8.35 μg (CI95 5.71 ～ 10.00 μg)、可乐定1.29 μg (CI95 0.88 ～ 1.70 μg)医.学.全.在.线www.med126.com。
因七叶皂苷单独用药对Ⅰ相痛无明显抑制作用，我们未能对混合用药时Ⅰ相炎症痛的作用进行进一步定量分析。等辐射分析法显示混合用药时，抑制Ⅱ相炎症痛的实际ED50在理论ED50下方，且不与理论ED50的95%置信区间连线相重叠，两者比较有统计学差异(图4)，表明七叶皂苷和可乐定混合用药对甲醛炎症痛(Ⅱ相)有协同抑制作用医.学.全.在.线www.med126.com。
