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4 讨论
聚集是重组抗体药物面临的一大难题。为保证生产过程中的稳定性以及适应临床应用的要求，对于抗体聚集的性质、规律和发生原因的研究是非常必要的。以此为基础，对聚集的改善可通过对抗体分子本身的改造或保存条件的优化来实现。
目前对于聚集现象的鉴定有多种方法，本文联用HPSE 和DLS 两种方法。HPSE具有用量少、灵敏度高、对不同聚集组分的比例定量精确等优点，但是上柱前高浓度样品经常要进行稀释处理，对于高浓度状态下样品的检测有一定误差。DLS 的优点是样品无需稀释，可以较为直观地从粒径大小来说明蛋白质的聚集情况，适合分析高浓度高分子量蛋白，但是不能精确将聚集程度定量。因此同时使用两种方法可以更全面的对聚集情况进行分析。
本实验中DLS 和HPSE 结果都证实聚集的存在，但DLS 对聚集程度的判定比HPSE 低，可能与DLS 本身精确度以及在操作时温度设置较高（20)有关，实验表明温度升高时会使抗体有所解聚。SDS-PAGE 和间接ELISA 实验证明hA21 在给定溶液中的聚集是通过非共价相互作用形成的，不同聚集形式都保留有抗原结合活性。这种非共价的聚集具有可逆性，可受溶液环境的影响，提示我们可通过优化保存条件对聚集加以改善：实验表明在接近中性的条件下，随着pH 值的升高聚集比例增加（数据略)，可能和接近抗体等电点有关（pI 约为8.75)，因此为了减少聚集，我们一般采取中性偏酸的缓冲液保存；本研究中我们以pH值为5.5 的醋酸钠缓冲液为代表，发现温度升高使抗体有所解聚，可能是由于此时疏水作用增强促进抗体分子内折叠，从而减少蛋白间相互作用引起的；甘露醇在低温下对抗体解聚作用不明显，但高温时的解聚作用影响明显，其机理有待于进一步分析。在这几种不同的聚集程度下单体比例多时抗体结合活性增强，提示聚集部位可能位于抗体可变区。尽管聚集程度有所差别，但抗体的天然构象基本维持不变，这也是抗体保持活性的基础。
抗体酶解片段的分析进一步显示hA21 的聚集可能主要是由可变区（单链抗体)的相互作用引起的。单链抗体是通过一段连接肽（linker)将抗体重链（VH)和轻链（VL)共价相连，VH 和VL 之间通过疏水作用折叠成抗原结合区。有文献报道单链抗体分子间的相互作用受linker 长短、VH 和VL 的氨基酸组成以及溶液环境影响，但一般认为连接肽大于15 个氨基酸的单链抗体主要以单体形式存在。hA21 的单链抗体的linker 具有20 个氨基酸仍有聚集趋势，可能与其本身独特的性质有关，本实验室已解析出hA21 单链抗体的晶体结构 ，将结合晶体结构进一步分析医.学.全.在.线网站提供。
嵌合抗体分子量仅为全抗体的三分之二，具有免疫原性低和穿透性好的特点，但是这类抗体的聚集特性目前所知甚少。本实验对hA21 抗体的可逆聚集现象进行了初步研究，探讨了影响聚集的因素，同时分析抗体的聚集部位，为今后抗体进一步改造提供了思路和依据。
