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2.2.3 SDS-PAGE 分析hA21 聚集的性质
分离胶浓度为8%，将经S300 分子筛层析柱分离的每个峰收集，浓缩后进行电泳检测，以上柱前的抗体作为对照，考马斯亮蓝R-250 染色显示蛋白条带。
2.2.4 间接E LISA 分析hA21 不同聚集形式的抗原结合活性
用高表达 ErbB2 的T6-17 细胞裂解液包被96 孔酶标板2 h，不表达ErbB2 的3T3 细胞裂解液为阴性对照。PBS-T 洗3 次，每次2 min，封闭剂（含1%脱脂奶粉的PBS-T)封闭1h，PBS-T 洗3 次，然后把S300 分离的各个峰以原液加到板上，振荡反应1 h，清洗后加入HRP 标记的羊抗人F 多抗反应1 h，最后用OPD 底物显色，检测在490 nm 的吸收值。
2.2.5 HPSE 和间接ELISA 比较温度、甘露醇对抗体聚集程度和活性的影响
将纯化后的抗体浓度调整为1 mg/mL，甘露醇的加入量与抗体的质量浓度比为20:1，对照组加入等体积缓冲液，将两组都分别放置于4和37过夜。用HPSE S300 进行分析，样品量均为30 μL，用仪器自带软件采用面积归一法计算每种条件下各个峰所占比例医.学.全.在.线www.med126.com，每种样品测三次取平均值。间接ELISA 检测不同溶液环境下抗体结合活性变化（抗体浓度均稀释为1 ng/μL)。
2.2.6 圆二色谱（D)分析抗体构象变化
远紫外光谱分析样品浓度为0.1 mg/mL，样品池容积为0.4 mL，从200-250 nm 每1 nm为一个测量值，近紫外光谱分析样品浓度为1 mg/mL，样品池容积为3 mL，从250-450 nm每1 nm 为一个测量值。以相应溶液为空白对照，扫描速度为100 nm/min，根据样品设置不同的水浴温度，结果取同一样品3 次扫描的平均值。
2.2.7 抗体的酶解分离以及聚集部位的分析
抗体置于 pH 7.0 的0.02 mol/L 的磷酸盐溶液中（含0.01 mol/L EDTA)，用木瓜蛋白酶酶解过夜，将酶解液用Protein A 亲和柱进行分离纯化，挂柱后洗脱下来的是含为抗体恒定区（F 段)的部分，未挂柱的为不含F 段的部分。将未挂柱的成分用Superdex G75 进一步精细纯化得到抗体可变区（单链抗体sFv)，保存于0.02 mol/L 醋酸钠溶液中（pH 5.5，0.2 mol/L Nal)，将纯化所得的sFv（浓度约0.2 mg/mL)同样用HPSE S300 进行分析。
3 实验结果
3.1 高效排阻色谱(HPSE)对抗体hA21 聚集现象的鉴定
纯化后的抗体经HPSE S300 分离出现连续的三个峰，出峰时间分别为14.36min、15.37 min 和16.92 min，根据出峰时间和标准分子量对照得出三个峰的分子量约分别为300 kD、200 kD 和100 kD，已知hA21 的单体分子量为105 kD 左右，因此这三个峰应该分别为抗体的三聚、二聚和单体形式，采用面积归一法得出峰1、峰2、峰3 分别占14.5%，22.6%以及62.9%。
