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动物生化学重要技术(离心技术)

来源:本站原创 更新:2011-11-24 执业兽医考试论坛

离心技术是将含有微小颗粒的悬浮液置于转头中,利用转头绕轴旋转所产生的离心力,将悬浮的微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。随着离心技术的不断发展及离心装置的不断完善,离心机的最大额定转速不断提高,经历了低速、高速、超速等发展阶段。离心机的结构也更加复杂,加入了冷冻系统、真空系统及具有自动控制功能的操作系统等,分析用超速离心机还装有分析光学系统,可用于样品的定量分析。电子计算机自动控制程序的引入使得样品相对分子质量、沉降系数及扩散系数等的测定自动化,为提高测定速度和测定结果的准确性提供了有利的条件。

一 基本原理
(一)相对离心力
离心技术是根据微小颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的。离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动,从而产生一个强大的辐射向外的离心力场,它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度,使之受到一个外向的离心力。离心机所产生的离心场(G),通常以如下方程式表示:
G=ω2r
式中,ω为转头的角速度,以rad/s表示,r为旋转半径(物质质点所处位置与旋转中心的距离)。离心场通常用相对离心力RCF表示,符号FRC,也就是离心力的大小相当于地心引力(即重力加速度g)的倍数来表示,即:
FRC=ω2r/g
公式进一步推导:FRC=1.119×10-5×n2r
式中n为转头转速,以转/分,简写成r/min)表示;g为重力加速度,等于980.6cm/s2.从式中可看出离心机的转头转速和相对离心力g或×g之间可以互相换算。医 学全,在线.搜集.整理www.med126.com一般在低速离心时(转速小于5000r/min),相对离心力的大小常用r/min来表示,而超速离心时则用×g来表示。
(二)沉降系数
沉降系数是指单位离心场作用下颗粒沉降的速度,以S来表示,
S=v/(ω2r)。
当我们对某些生物高分子和亚细胞器组分的化学结构、相对分子质量还不了解时,可以用沉降系数对它们的物理特性进行初步描述,将它们区分开来。例如大肠杆菌核蛋白体是70S,它由两个亚基组成,用超离心的方法测得其沉降系数分别为30S和50S,当我们还不清楚它们的结构时就暂以30S和50S命名以示区别。
沉降系数S的值与颗粒的大小、形状和密度,以及离心所使用的介质的密度和粘度有关,而与转头的速度和类型无关。
因为实际测定沉降系数的条件各不相同,必须进行标准化才能准确地描述颗粒特性。
公认的标准介质是20℃的水,它的密度和粘度(ρ20,w,η20,w)是已知的。在这种标准介质中所确定的颗粒的沉降系数只依赖于颗粒本身的两个参数,即颗粒大小和密度,而这两个参数可以用离心的方法确定。颗粒在20℃水中的沉降系数称为其沉降常数S20,w. S20,w与它的测量状态无关,因而具有通用的特性。
确定沉降常数没有必要一定在水中进行离心。如果已知介质的特征值(ρm,ηm),就可利用在该介质中离心的数据确定沉降系数S,再将S20,w的表达式除以S的表达式,即可求出颗粒的沉降常数。
(三)沉降速度
沉降速度是指在强大的离心力作用下,单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。颗粒沉降速度与下面三方面因素有关:
(1)颗粒本身的性质 沉降速度与颗粒直径和密度成正比。密度相同时大颗粒比小颗粒沉降快;大小相同时,密度大的颗粒比密度小的沉降快。
(2)介质的性质 沉降速度与介质的粘度、密度成反比,介质粘度、密度大,则颗粒沉降慢。
(3)离心条件 颗粒沉降速度与离心时转速和旋转半径成正比。如果其他的条件不变,沉降速度随着r的增大而增大,在进行速度区带离心时,r对沉降速度的这种影响不利于达到满意的分离效果,所以需要在沿半径方向上相应地增加介质的密度和粘度以克服r的增加造成的影响。
(四)沉降时间
分离某物质所需的时间常用反复多次的实验来取得。如果已知该物质的一些物理特性,也能用沉降时间来计算分离该物质所需的分离时间。样品颗粒完全沉降到管底内壁的时间tm,可以下列方程式表示:
tm=(1/S)*( lnx2- lnx1)/ ω2式中,
x2表示旋转中心到离心管底内壁的距离;
x1表示旋转中心到样品溶液弯月面之间的距离
S表示样品沉降系数


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