公开(公告)号 | CN1560253A |
公开(公告)日 | 2005.01.05 |
申请(专利)号 | CN200410007534.3 |
申请日期 | 2004.02.25 |
专利名称 | 多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备 |
主分类号 | C12N15/31 |
分类号 | C12N15/31;C12N1/21;C12P21/00;A61P31/04 |
分案原申请号 | |
优先权 | |
申请(专利权)人 | 中国人民解放军第三军医大学 |
发明(设计)人 | 胡福泉;饶贤才;黎庶;胡金川 |
地址 | 400038重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号 |
颁证日 | |
国际申请 | |
进入国家日期 | |
专利代理机构 | |
代理人 | |
国省代码 | 重庆;85 |
主权项 | 多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备,其特征是:首先根据肽抗生素hPAB氨基酸序列对应的核苷酸序列设计一对PCR引物:上游引物P1:下游引物P2:然后通过PCR技术在hPAB基因的5’端依次加上核酸内切酶BamHI、AvaIII,天冬酰胺对应的核苷酸序列,在hPAB基因的3’端依次加上甘氨酸对应的核苷酸序列,核酸内切酶PstI,终止密码子TAA和核酸内切酶HindIII。PCR产物回收后用BamHI和HindIII酶切,用T4DNA连接酶将之连接到pQE-32表达质粒的BamHI/HindIII位点上,采用酶切、核苷酸测序筛选阳性重组子。提取阳性重组子质粒,分为两份,一份用XhoI+AvaIII双酶切后回收大片段(含单拷贝hPAB),另一份用XhoI+PstI双酶切后回收小片段(含单拷贝hPAB),将大、小片段用T4连接酶连接后即可得含双拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-2;若再将pQE-hPAB-2质粒分两份,一份用XhoI+AvaIII双酶切后回收大片段(含双拷贝hPAB),另一份用XhoI+PstI双酶切后回收小片段(含双拷贝hPAB),将大、小片段用T4连接酶连接后即可得含四拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-4;若将上述双酶切后含双拷贝hPAB的大片段与含单拷贝hPAB的小片段连接即可获得含三拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-3;如此重复,分别构建含1~8拷贝hPAB重组体的工程菌,进行表达。上述克隆的技术路线如下:BamHIAvaIIIAsnhPABGlyPstIStopcodonHindIIIGGATCCGATGCAAAC=GGCCTGCATTAAAAGCTT |
摘要 | 本发明公开了一种多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备方法。通过分子生物学操作,将hPAB构建成多拷贝体,并由表达载体介导在大肠杆菌中高效表达,多拷贝体表达量占细菌总蛋白的15~25%。以三拷贝工程菌为例,表达量为20%,纯化的一个三拷贝体分子经裂解可获得3个活性单体,制备效率增加了200%。本发明公开的制备方法具有分离纯化方法简单,成本低,易于放大,产物纯度高、杀菌力强等优点,可广泛地应用于医药、食品保鲜及护肤品等领域。 |
国际公布 |