| 公开(公告)号 | CN1300172C |
| 公开(公告)日 | 2007.02.14 |
| 申请(专利)号 | CN200310113790.6 |
| 申请日期 | 2003.11.25 |
| 专利名称 | 一种抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体 |
| 主分类号 | C07K16/10(2006.01)I |
| 分类号 | C07K16/10(2006.01)I;A61K39/395(2006.01)I;A61K9/12(2006.01)I;A61K9/08(2006.01)I;A61K9/10(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I;A61P11/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 |
| 发明(设计)人 | 王希良;杜新安;石辛甫;张松乐;刘建源;李 岩;赵光宇;田 光;周 华 |
| 地址 | 100071北京市丰台区东大街20号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 北京太兆天元知识产权代理有限责任公司 |
| 代理人 | 张 韬 |
| 国省代码 | 北京;11 |
| 主权项 | 一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体，其特征在于该抗体是由如下制备方法制成的： 1)灭活纯化的SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹，免疫四次、间隔10天免疫一次，试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800，测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800，并且不同的SARS-CoV标准毒株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性； 2)采集马抗SARS-CoV血浆，用无热源2倍蒸馏水稀释加入21％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白，上清再加入9％饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G，用无热源蒸馏水恢复原体积再用30％饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG，先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9％氯化钠盐水用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，超滤液为纯化的马抗SARS-CoV IgG； 3)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氢氧化钠调PH至7.4，加热58℃、30min，用帆布过滤去Fc段，滤液为初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体； 4)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基疏水层析柱Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱，20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液，再用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩，得纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体； 其中灭活纯化的SARS-CoV由如下方法制得： 1)绿猴肾细胞的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞； 2)SARS冠状病毒滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养测定SARS-CoV病毒的毒力，其半数感染量为106-108，对滴定的SARS-CoV分装冻存； 3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV，生产SARS-CoV； 4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次，-37℃冰冻或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液； 5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果； 6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液； 7)用截留分子量为30万的超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活的SARS-CoV； 8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱，开始缓冲液是0.1MPBS PH7.0缓冲液，用100mM PBS PH7.0洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化的SARS-CoV； 9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析，用100mM PB，PH7.2液平衡并将病毒吸附在柱上、用100mM PB，PH7.2，0.35M NaCl洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化的SARS-CoV； 10)纯化灭活的SARS-CoV分装放-70℃保存。 |
| 摘要 | 本发明涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体，特征在于该抗体为马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体，同时本发明公开该抗体的制备方法。本发明抗体能特异消灭SARS-CoV，对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果。 |
| 国际公布 |
