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1 材料与方法
1.1 主要试剂
RPMI1640培养基购自GIBCO公司，粉防己碱(Tet)购自上海友思生物技术有限公司，根据文献[7]以双蒸水稀释粉防己碱，配置浓度为0.1mmol/L的粉防己碱储存液(0.1mol/L HCl助溶，0.1mol/L NaOH调整pH值至6.6～6.7)，4℃保存，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Amresco公司，Annexin-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Bipec公司，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。
1.2 细胞株和细胞培养
宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学临床医学研究分子中心提供。常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养条件为37℃，50mL/L CO2饱和湿度，待细胞长至80%融合时，2.5g/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。
1.3 MTT法检测宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率
取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度5×104个/mL，以200μL/孔接种于96孔板，37℃，50mL/L CO2培养箱中培养24h，以粉防己碱终浓度为10、12.5、15、17.5、20、30μmol/L处理细胞。每个浓度设三个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照，分别于作用24、48、72h后每孔加入50mg/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h后，终止培养，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm处测量A值，按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。
1.4 实验分组
实验分为对照组和处理组。对照组即正常生长的HeLa细胞;处理组即给予粉防己碱处理的Hela细胞。
1.5 AnnexinV/PI双染法流式细胞数检测细胞凋亡
以0μmol/L，15μmol/L粉防己碱处理细胞24h后，收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。取1mL细胞，2000r/min，4℃，离心10min，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞，400μL 1×Binding Buffer重悬细胞，密度为1×106个/mL。加5μL AnnexinV-FITC，轻柔混匀，在4～8℃避光孵育15min。再加10μL PI，在4～8℃避光孵育5min。于1h内上流式细胞仪检测。
1.6 AnnexinV/PI双染法激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学变化
将对数生长期HeLa细胞以1×105个/mL接种于预先置有盖玻片的无菌6孔板中，终体积为2.5mL。待24h贴壁后，加入粉防己碱，使其在培养基中终浓度为15μmol/L，同时设不加药的对照组。作用24h后，按AnnexinV-PI细胞凋亡试剂盒步骤染色，封片后立即用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞并拍照。结果判定：正常活细胞AnnexinV和PI均为低染;凋亡早期的细胞膜完整，AnnexinV高染呈绿色，PI为低染;凋亡中晚期细胞则AnnexinV和PI均为高染，细胞膜呈绿色，细胞核呈红色医.学.全.在.线www.med126.com。
1.7 统计学处理
实验均重复3遍，实验结果用均数±标准差(±s)表示，并用SPSS13.0软件对实验结果进行分析。MTT法试验结果用两因素方差分析检验，其余试验结果进行两独立样本均数的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有增殖抑制作用
