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1材料和方法
1.1材料pGenesil1shRNA质粒前期实验已构建成功， pAdTrack,pAdEasy1质粒，DH5α,Top10,BJ5183菌种，293细胞由重庆医科大学基础研究所实验室提供，限制性内切酶EcoR I,Sal I购自Takara,T4 DNA连接酶购自Promega公司，Pme I,Pac I购自New England Biolab公司，测序引物由重庆升博生物技术有限公司合成. 质粒小量抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司，胶回收试剂盒购自Genemega公司，PCR试剂盒购自BioFlux公司医.学.全.在.线www.med126.com.
1.2方法
1.2.1腺病毒穿梭载体pAdTrackU6shRNA的构建将pGenesil1用HindⅢ和Sal I双酶切，回收小片段，再将腺病毒穿梭质粒pAdTrack用HindⅢ和Sal I双酶切，回收大片段，4℃下T4 DNA连接酶连接过夜，阳性克隆HindⅢ和Sal I双酶切鉴定，EcoRI单酶切鉴定，进一步经DNA双向测序确认构建无误.
1.2.2重组腺病毒载体pAdEasyU6shRNA的构建采用细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒pAdEasyU6shRNA. 先将pAdEasy1转化人大肠杆菌BJ5183，制备AdEasy1细菌. 从AdEasy1细菌中抽提质粒pAdEasy1并用HindⅢ酶切，选取与原始pAdEasy1质粒具有相同酶切图谱的AdEasy1菌株，再按氯化钙法制备成AdEasy1感受态细菌. 重组穿梭质粒pAdTrackU6shRNA经Pme I线性化后取约150 ng转化100 μL AdEasy1感受态细胞，在浓度为50 mg／L卡那霉素抗性LB平板上筛选，37℃培养18～20 h后，挑选体积最小的克隆，立即摇菌抽提质粒，用PCR及Pac I酶切鉴定，由于目的基因有4条，针对每一条分别设计引物代价较大，于是在目的基因两端设计引物，扩增出含有目的基因的大片段. 引物序列如下：(Sense primer) 5′ GCCAAGTGGGCAGTTTACC 3′,(Antisense primer) 5′ TAGAGTTTGCGGGCAGGAC 3′.对PCR产物进行DNA序列测定. PCR反应参数：94℃变性5 min. 94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环后，72℃延伸8 min. 鉴定后pAdEasyU6shRNA在大肠杆菌Top10中扩增.
1.2.3重组腺病毒的包装与扩增①293细胞培养：常规复苏293细胞，用含100 mL/L胎牛血清和100万U／L青霉素，100万U／L链霉素的DMEM培养液培养，达对数生长期时按1∶5传代，部分冻存建库，部分为实验用. ②293细胞转染：重组pAdEasyU6shRNA质粒经Pac I酶切过夜充分线性化后乙醇沉淀线形DNA. 用Lipofectamine2000阳离子脂质体进行转染：当25 cm2细胞丰度达70％ 时(转染前1 d血清无双抗DMEM培养)，取10 μL脂质体和4 μg DNA分别用500 μL单纯DMEM培养基稀释后再混合，混合液加入1 mL 单纯DMEM培养基中和细胞在37℃，50 mL/L CO2培养箱孵育，5～6 h后将转染液更换为6 mL DMEM完全培养基. ③病毒的包装与扩增：细胞出现CPE前正常换液，出现CPE后用NaHCO2调节培养液pH值，转染8 d后细胞大量脱落，此时进行收集. 1000 r／min低速离心去培养液，用1 mL PBS重悬细胞，于-80℃和37℃之间反复冻融3次，4℃下5000 r／min离心20 min收集病毒上清. 第一批上清液进行PCR鉴定，重组的病毒颗粒反复感染293细胞进行大量扩增(共2次，每次感染2个规格为75 cm2方瓶细胞量). 病毒液用0.22 m滤膜无菌过滤后分装于2 mL冻存管，-80℃保存. ④重组腺病毒滴度测定:在24孔板中接种1×105细胞/孔，待细胞达到70％融合时加入用DMEM 培养液等比稀释的待测病毒400 μL，放置37℃吸附90 min后，吸弃病毒，加入1 mL DMEM完全培养基继续培养18～24 h后，于荧光显微镜下计数GFP 阳性细胞数. 按下列公式计算病毒滴度: 病毒滴度（pfu/mL)＝（GFP 阳性细胞数×病毒上清稀释倍数)/0.4 mL ⑤重组腺病毒PCR鉴定：取第一轮扩增后收集的病毒上清5 μL，加入10 μL蛋白酶K，55℃孵育1 h，100℃沸腾5 min，离心后取1～2 μL上清 进行PCR 鉴定. PCR反应参数为：94℃变性5 min， 94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环后，72℃延伸8 min. PCR产物送生物技术公司测序医.学.全.在.线www.med126.com.
2结果
