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1 材料与方法
1.1 材料 人宫颈癌Hela细胞由河北医科大学病理教研室提供;大蒜素(二烯丙基代磺酸酯)购于河北医科大学第二临床医院药房;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Ho33342、碘化丙啶(PI)为美国Sigma产品;DMEM、新生牛血清为美国Gibco产品;Bcl2、Bax单克隆抗体购自美国BD公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养:人宫颈癌Hela细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下静置培养。选择对数生长期细胞进行分组实验。
1.2.2 MTT法检测大蒜素对细胞增殖的影响：细胞以5×104/ml的密度接种于96孔培养板中，培养48 h后，每孔加入不同浓度的大蒜素各100 μl，浓度分别为1、5、10、20 μg/ml，对照组加入含10%FBS的培养基，分别培养12、24、48 h后，分别向每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入DMSO 100 μl，振荡5 min;酶标仪检测(吸光度为550 nm)。每时间浓度组设3个复孔，实验重复3次。所得OD值根据公式计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=(1-OD实验组/OD正常组)×100%，以空白组OD值调零。
1.2.3 大蒜素诱导宫颈癌：Hela细胞凋亡最适浓度筛选以上各实验组加入大蒜素作用24 h，加入Ho33342(浓度10 μg/ml)37℃温育20 min，再加入PI(浓度50 μg/ml)，荧光显微镜观察并记录图象。
1.2.4 细胞形态学观察：10 μg/ml大蒜素分别作用0～24 h，每隔2 h显微镜观察1次，随机选取视野记录图象。
1.2.5 流式细胞仪检测：大蒜素对细胞周期的影响：细胞以5×104/ml-1接种于25 cm2培养皿中，培养48 h后，加入10 μg/ml大蒜素，分别培养12、24 h，弃培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心8 min收集细胞。细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后，500 μl PBS悬浮细胞，加入含10 μg/ml的RNase的PI，4℃染色30 min。经200目滤网过滤后，上机检测。实验结果采用Modifit软件进行细胞周期各期的百分率分析。实验重复3次。
1.2.6 流式细胞仪检测大蒜素对Bcl2和Bax的影响：细胞以5×104/ml接种于25 cm2培养中，培养48 h后，加入10 μg/ml大蒜素分别培养12和24 h，收集细胞，以PBS清洗3次，70%乙醇4℃固定1 h。经PBS再次清洗后，不同时间组细胞分别加入兔抗人Bcl2或兔抗人Bax一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗后加入FITC标记山羊抗兔二抗，37℃避光孵育20 min。阴性对照PBS代替一抗。PBS 清洗3次后上流式细胞仪检测，实验重复3次。
1.3 统计学分析 应用SPSS 11.0统计件，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义医.学全.在.线网站www.med126.com。
2 结果
2.1 大蒜素对宫颈癌Hela细胞活性的影响 MTT结果显示1～10 μg/ml大蒜素均能抑制Hela细胞的增殖 ，呈时间剂量依赖性关系;20 μg/ml大蒜素细胞毒性作用明显，作用12 h，细胞抑制率为74.71%，作用24 h以后细胞几乎全部死亡。见表1。表1 大蒜素对Hela细胞增殖的抑制作用
2.2 大蒜素诱导宫颈癌Hela细胞凋亡最适浓度的筛选Ho33342和PI染色结果提示，各浓度组中，10 μg/ml大蒜素对Hela细胞诱导凋亡作用最明显;20 μg/ml大蒜素主要表现为细胞毒性作用。因此，本实验选取10 μg/ml作为最适诱导浓度来探讨其作用机制。
2.3 细胞形态学观察正常条件下Hela细胞呈梭形或多角形，传代培养48 h，细胞贴壁生长，有聚团现象;10 μg/ml大蒜素作用6 h，细胞开始出现形态学改变，紧贴瓶壁的细胞边界模糊，部分细胞缩起，分裂相减少;大蒜素作用12 h开始有凋亡小体出现;大蒜素作用24 h，大部分细胞回缩变圆，凋亡小体明显，部分细胞悬浮于培养基中，细胞碎片增多。
