 |
 |
1 材料与方法
1.1 材料 实验动物采用健康孕期15d孕鼠，由第四军医大学实验动物中心提供;盐酸Lig注射液为哈尔滨三联药业有限公司生产;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO) 、L多聚赖氨酸、阿糖胞苷为美国Sigma公司产品;胰蛋白酶、DMEM培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清为杭州四季青有限公司产品;6孔板/Ⅱ96孔板为丹麦Costar公司产品;乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;其他试剂均为国产分析纯。Olympus倒置相差显微镜(日本)，CO2培养箱(NAPCO公司)，酶联免疫检测仪(美国BIOTek公司)，兔抗大鼠AchE抗体(1∶1000)、羊抗兔IgG(1∶200)、ABC及DAB显色试剂盒(美国VECTOR公司)。
1.2 海马神经元的原代培养[2] 健康孕15d的SD大鼠，麻醉后无菌条件下取胎鼠脑，解剖显微镜下取出的双侧海马，去除脑膜和血管，2.5g/L胰酶37℃消化10min，用完全培养基(90% DMEM+10% FBS)终止消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的24孔/96孔细胞培养板，置于50mL/L CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。12h后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的过度增殖，以后每周换液2次，每次换1/2培养液。培养至神经元分化完全后进行实验。
1.3 海马神经元Glu损伤模型的建立及分组[3] 海马神经元按上法培养7d后，去除原来培养基，用Lockes液(154mmol/L NaCl、5.6mmol/L KCl、 3.6mmol/L NaHCO3、2.3mmol/L CaCl2、5.6mmol/L Glucose、5mmol/L HEPES，pH 7.4)洗涤细胞3次，每次5min。谷氨酸损伤组，以Lockes液配制1mmol/L Glu 20～22℃作用于培养细胞20min，撤除Glu，用Lockes液洗涤细胞3次，每次5min，重新加入原培养基继续培养12h。实验组用Lockes液含有1mmol/L Lig加入细胞中培养12h后，再加入Glu作用20min。对照组Lockes液无Glu和Lig。
1.4 免疫细胞化学染色 海马神经元按上法培养7d后，除去培养液，用0.01mol/L PBS洗涤一次，加入40g/L多聚甲醛，室温下固定1h，去除固定液，用0.01mol/L PBS室温下洗涤10min，共3次。用含50mL/L羊血清、含1mL/L Triton X100的PBS液在37℃条件下封闭30min，去除封闭液。滴加一抗(rabbit antiACh monoclonal antibody，1∶1000)，4℃放置过夜，PBS洗。滴加二抗(goat antirabbit IgG, 1∶200 )，室温放置2h，PBS洗。实验中设不加一抗的空白对照组，除以PBS代替一抗外，其余步骤同上。DAB显色，显微镜下观察免疫细胞化学染色结果。用Image Pro Plus 6.0图像分析软件行细胞灰度值检测，每张爬片随机取5个视野，每个视野随机取10个细胞，取其平均值医.学全.在.线网站www.med126.com。
1.5 MTT法检测海马神经元的活性 各实验组每孔加10μL MTT(5g/L)放入37℃、50mL/L CO2培养箱中培养4h。然后每孔加人100μL浓度为200mg/L SDS，继续培养12h，用酶联免疫检测仪测定570nm的吸光度。每个实验组设8个复孔，实验重复3次。吸光度比值代表细胞活力。以空白对照组作为参照，其细胞生长率为100%。各组生长率=(各组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。
1.6 乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 收集培养基上清液，剩余培养液-20℃冰箱冻存7h之后，解冻，按试剂盒说明分别测定原上清液LDH的活性和培养板中剩余培养液冻溶后的LDH活性，计算LDH漏出率。
LDH漏出率(%)=上清液LDH活性/(冻溶后细胞培养液LDH活性+上清液LDH活性)×100%
1.7 统计学处理 实验数据应用Graph Pad Prism 5.0统计软件分析。数据以均数±标准差(±s)表示，显著性检验采用单因素方差分析。以P<0.05作为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 海马神经元的培养 相差显微镜下观察发现，体外培养2h大部分细胞己经贴壁生长，此时可见少数神经元伸出1～2个突起。培养至2d突起增多，但神经元突起的联络较少。培养7d时，神经元胞体呈椭圆形或三角形，胞体周围光晕明显，反光均匀一致，立体感强，神经元突起的主干和分支明显延长、增粗，相互联系增多(图1)。
