医学免疫学-实验指导

医学免疫学实习指导

河北医科大学基础医学院

免疫学教研室

二零零五年七月

实验要求及实验室规则

一、进入实验室要穿白大衣，必要时要戴帽子和口罩。进入实验室后要按规定位置就座，实验课进行时，不准随意出进。

   二、要保持实验室安静。实验室绝对禁止饮食、吸烟、用嘴湿润铅笔和标签等。实验材料、动物等均需按规定处理，不要乱动乱放，未经许可，不得将实验室的物品携带出室外。

   三、实验室用的玻璃器材，如玻片、试管等，根据试验要求，用前需用蜡笔马上标记，如实验日期、组别、姓名等，以免混淆。

   四、注意防火。火源不要接近易燃物品（如棉塞、酒精、二甲苯等)。实验结束后，应检查门、窗、水、电、火、防止发生事故。特别是实验材料，一律不准带出室外，以防意外，使用实验器材、药品要爱护，并注意节约。

   五、实验完毕，整理实验台，将台面器材、物品放回原处，用肥皂洗手后，再离开实验室。

免疫学实验课评分标准

实验课学期总成绩:20分，其中：

实验报告——5分

平时成绩——10分

期末考试——5分

各项判断标准：

1、实验报告

内容（原理、步骤、结果、讨论)——4分

书写（认真、详细)——1分

2、平时成绩

以10分为基准点，包括实验完成情况（课堂提问、动手操作、实验态度)、课堂纪律（着装、迟到、早退、旷课)以及值日生表现等方面。

加分：

☆班长—— ＋0～1

√志愿者—— ＋1～2

扣分：

□上课没穿白大衣—— -1

○未按要求完成值日任务—— -1

×迟到或早退1次—— -1

△未按时交实验报告—— -1（如为抄袭，双方均 -1分)

？旷课1次（无班主任或医生的证明)—— -2；

旷课3次或3次以上本学期试验课记为0分。

3、期末考试

以试卷实际成绩为准。

备注： （1)总分以20为限，超出不再累计；

（2)如有特殊情况，须请示主任及实验负责老师后，方可酌情处理。

备注：任课老师在免疫实验课评分中可参考以上评分标准灵活应用，实事求是的打分！

实验一 凝集反应

实验性质：验证性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

一、ABO血型的测定（直接凝集玻片法)

（一)实验目的 了解ABO血型鉴定的原理；掌握玻片凝集试验的方法。

（二)实验原理  已发现人类红细胞有20多种血型系统，其中ABO血型系统在输血中最为重要，必须血型相合才能输血。血型鉴定是根据人类红细胞表面有不同的血型抗原，故用已知的抗A、抗B单克隆抗体作直接玻片凝集试验，可测定血型。

（三)实验材料 

1、诊断用抗A及抗B单克隆抗体试剂各一支。

2、玻片、无菌刺血针、消毒用碘酒、酒精、无菌棉签、牙签，记号笔等

（四)实验方法

1、取洁净玻片一张用蜡笔分成两半，分别标记A、B，然后A侧滴一滴抗A抗体（蓝色)，B侧滴一滴抗B抗体（黄色)

2、被检者耳垂或手指用碘酒消毒，酒精脱碘并凉干后，用刺血针刺血。

3、用牙签刮取两滴血液充分与两种抗体混匀，即可观察结果

（五)实验结果

血 型 鉴 定 结 果

（六)注意事项

1、A、B两侧不能混，否则结果不可靠。

2、无菌观念：消毒按一定方向，以一点为中心，由内向外；注意酒精脱碘，否则损伤皮肤、色素沉着；酒精脱碘后，要晾干，否则进针会有烧灼疼痛；

二、试管直接凝集（直接凝集试管法)

（一)实验目的  了解试管凝集的反应；掌握倍比稀释的方法和血清凝集效价的定义。

（二)实验原理  试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。用已知的定量抗原与一系列倍比稀释的待检血清，在试管内混合，经一定的时间保温静止后，出现凝集，通过观察各管的凝集程度，可定量检测血清中的抗体水平。通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价，亦称为滴度

（三)实验材料 

1、抗原：灭活伤寒杆菌“H”菌液一管

2、抗体：伤寒杆菌H免疫学清

3、生理盐水

4、试管、吸管、试管架、水浴箱等

（四)实验方法

1、取试管7支，编号1-7,每加生理盐水0.5ml。

2、于第一管中加入伤寒杆菌免疫学清0.5ml，吹吸混匀6次；取出0.5ml加入第二管，吹吸混匀6次；再取0.5ml加入第三管，依次类推至第六管，吸出0.5ml弃之。第七管不加血清，作为对照。

3、各管分别加入伤寒杆菌“H”菌液0.5ml，震荡混匀。

4、置50℃水浴箱温育2小时，轻轻取出试管，观察结果。

（五)实验结果

1、++++：细菌全部凝集，凝集块完全沉于管底，液体清晰透亮。

2、+++：细菌大部分凝集，凝集块沉于管底，液体稍浑浊。

3、++：细菌部分凝集，管底凝集物较前两者少，仍明显，液体半澄清。

4、+：液体浑浊，液体中可见非常小的凝集物，须仔细观察才能发现。

5、—：无凝集物，液体浑浊度与对照管相同。

（六)注意事项

1、取样加样准确。

2、控制温度，过高（超过55℃)，可导致抗体的破坏。

3、由水浴箱取出试管时，勿震动，避免凝集物悬起，影响结果的观察。

4、观察结果要与对照管比较后判断，避免凝集是因为自凝导致的。

三、间接凝集抑制实验（妊娠诊断实验)

（一)实验目的  掌握间接凝集抑制实验的原理及方法；掌握妊娠诊断实验的操作过程

（二)实验原理  将可溶性抗原或相应抗体预先混合作用后, 再加入该抗原致敏的载体颗

粒，由于抗体已被可溶性抗原结合,阻断了抗体与载体上的抗原作用,不再出现凝集现象,称

为间接凝集抑制试验。孕妇末次月经后40-90天左右尿液中（人绒毛膜促性腺激素)含量增

高，若将一滴孕尿，加一滴抗血清（HCG免疫家兔获得)，充分反应后，再加一滴乳胶抗原，

不出现凝集颗粒，为妊娠试验阳性，反之，则为阴性。

（三)实验材料

1、孕妇尿液、正常尿液

2、胶乳抗原、抗血清（兔抗人HCG的抗体)

3、玻片、牙签、滴管

（四)实验方法

1、取一张玻片，用蜡笔分成两半，标记“+”，“-”。

2、“+”侧加一滴孕尿，“—”侧www.med126.com加一滴生理盐水（作为对照)。

3、两侧各加一滴抗血清（抗HCG)，轻轻晃动玻片0.5-1min。

4、两侧再加一滴胶乳抗原，分别混匀，放置5min，强光下观察结果。

（五)结果观察

1、“+”侧呈均匀浑浊乳液，为妊娠实验阳性；

2、“-” 侧出现均匀一致的白色细沙样颗粒，为妊娠实验阴性

（六)注意事项

1、胶乳抗原使用前应混匀。

2、加入的尿标本、抗血清和胶乳抗原每滴大小一致。

3、加入抗血清后，充分混匀使可溶性抗原与抗体充分反应。

实验二 沉淀反应

实验性质：验证性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

一、环状沉淀试验(ring precipitation test)：即沉淀反应的试管法。

（一)实验目的：了解环状沉淀实验的原理及用途；了解简单快速测定微量抗原的方法

（二)实验原理：在小口径（直径小于0.5cm)试管内（现用环沉管)先加入未稀释的已知抗血清，再小心加入稀释的可溶性待检抗原于血清层上面，使之成为分界清晰的两层，阳性者，数分钟后在抗原与抗体相遇界面处出现白色沉淀环，此实验称为环状沉淀试验。

应用：常用于鉴定微量抗原，如法医学鉴定血迹；细菌分型等。特点：此法简便易行，需用材料较多（用抗体较多，且应用效价较高的抗体)是其缺点。

（三)实验材料

1、抗原：绵羊血清、豚鼠血清

2、抗体：抗绵羊血清

3、生理盐水、环沉管、环沉管架、毛细滴管

（四)实验方法

1、用毛细滴管在3支沉淀管中加抗体（0.2ML抗绵羊血清)。

2、毛细滴管分别加1：40、1：320稀释的抗原、NS，沿管壁缓缓加入，使成明显界面。

3、小试管置于架上，室温放置数分钟后，观察两液面交界处有无白色沉淀环。

（五)注意事项

1、抗原：抗体=1：1（体积比)。

2、加抗体时伸入试管底部。

3、加抗原时沿管壁缓缓加入。

4、用豚鼠血清和生理盐水做抗原的对照。

二、对流免疫电泳：(counterimmunoelectrophoresis,CIE)

（一)实验目的：掌握对流免疫电泳的原理、方法和结果分析

（二)实验原理：

双向琼脂扩散与电泳技术相结合的方法。

1、半固体琼脂凝胶：沉淀反应是在半固体琼脂凝胶中进行的。半固体琼脂犹如网状支架，内含大量水分，可溶性抗原和抗体可在其中自由扩散。

2、电泳：指液体中的带电颗粒在外加电场影响下的移动现象叫电泳。

3、电渗：是电场中溶液对于固体的相对移动。

在本实验中：琼脂是酸性物质，所使用的缓冲液是pH8.0的巴比妥缓冲液，因此在碱性溶液中，固体琼脂带负电；而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动，产生电渗。 

在琼脂电泳中，电渗与电泳同时发生，物质的最终运动方向取决于合力的方向。液体的流动均匀而缓慢，一般不致影响带电颗粒的电泳方向。但如果带点颗粒带电荷少，泳动速度慢，电渗作用占主导。

4、液体的pH值高于颗粒的等电点时颗粒带负电荷，溶液的pH值离某物质的等电点越远，该物质带的电荷越多。

在本实验中：

缓冲液：是pH8.0的巴比妥缓冲液。

抗原：等电点4—6，带负电。

抗体：等电点6.8-7.2,带负电少

分子量大，泳动速度慢

电渗作用大于电泳作用

5、负极侧：加抗原在电场作用下从阴极向阳极移动

正极侧：加抗体在电渗作用下从阳极向阴极移动  

在比例最适处形成白色沉淀线。

6、电泳的目的：限制了抗原抗体向多方向的自由扩散；加速了泳动的速度，所以缩短了反应的时间，仅需30-60分钟；灵敏度比双向扩散高10-15倍；特异性不如双向扩散，因为一对以上的抗原抗体系统产生的沉淀线易重叠。

（三)实验材料

1、抗原：绵羊血清、豚鼠血清

2、抗体：抗绵羊血清

3、生理盐水、琼脂板、电泳槽、电泳仪、毛细滴管

（四)实验方法

1、打孔

  +Ab  _Ag

用打孔器按照上述所示打孔（不要太靠边，以防电泳时不好搭桥)。

2、加样：加满，不要溢出。

阳极加抗体，Ab：兔抗羊血清；

阴极加抗原，Ag：1:40；1:80；1:160稀释的羊血清。

各浓度分别作两份，上下两组完全相同。

3、电泳：一起电泳。每cm宽度4mA，1个玻片约10mA，8个玻片约80mA。电泳40分钟-50分钟。搭桥应完全紧密接触，以防电流不均而发生沉淀线歪曲

（五)注意事项

扩散时间要适当。时间过短，沉淀线不能出现；时间过长，会使已形成的沉淀线散开而出现假象。

（六)结果分析

1、沉淀线的位置由抗原抗体的浓度决定：若抗原与抗体的浓度相等，则沉淀线在两孔中间；若抗体和抗原的浓度不等，则沉淀线靠近浓度低的一方。

2、沉淀线的形状由抗原抗体的分子量决定：若抗原与抗体的分子量相当，则沉淀线成直线；若抗体和抗原的分子量不等，则沉淀线呈弧线，弯向（凹向)分子量大的一方。

三、单向免疫扩散试验(single immunodiffusion)：

定量实验，常用已知的抗血清测定未知量相应抗原。

（一)实验目的：了解实验原理及如何用此方法定量检测抗原的含量

（二)实验原理

将抗血清与琼脂混匀，制成含抗体的琼脂板，在琼脂板上打孔，孔内加入不同浓度的抗原。因为抗体已与琼脂混合，所以不会再扩散，只有抗原在琼脂中由小孔向四周扩散，所以命名为单向免疫扩散试验。扩散过程中，抗原抗体比例合适的部位形成沉淀环，沉淀环的直径与加入的抗原浓度成正比。若先以不用浓度的标准抗原作单向扩散，以沉淀环直径平方为纵坐标，抗原浓度为横坐标，制成标准曲线。待检抗原的量可从标准曲线中查出。

应用：常用于检测体液中免疫球蛋白和补体各成分的含量。

（三)实验材料

1、抗原：待检人血清

2、生理盐水、单向免疫扩散琼脂板、毛细滴管

（四)实验方法

1、（每大组一块)在含有抗体的琼脂板中分别加入4个不同浓度的抗原1、2、3、4（加满但不要溢出)。

2、湿盒中室温放置48小时后观察结果。

四、双向琼脂扩散试验 (double immunodiffusion)

（一)实验目的：掌握实验原理、方法、应用，正确解释实验结果

（二)实验原理：抗原和抗体在相同的环境下自由扩散。在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体，抗原和抗体从小孔向四周扩散，当二者比例合适，形成免疫复合物的沉淀线。【若反应材料中有两种以上的抗原抗体系统，则两孔间可出现多条沉淀线。】

应用：检测抗原或抗体的纯度，滴定抗体的效价；临床上常用于检测AFP，作为原发性肝癌的重要诊断指标。

（三)实验材料

1、抗原：绵羊血清、豚鼠血清

2、抗体：抗绵羊血清

3、生理盐水、琼脂板、毛细滴管

（四)实验方法

1、打孔：

2、加样：中间孔加抗体：兔抗羊血清

四周6个孔中各孔分别加入：1:40；1:80；1:160；1:320；1:640稀释的抗原（羊血清)和生理盐水，加满但不要溢出；左右两组相同，同时作两份。

3、将琼脂板置于湿盒中，室温下放置24小时后观察结果。

（五)结果分析

上面两孔为抗原，下面一孔为抗体

⑴  ⑵  ⑶

1、两抗原完全相同（接口处不象画的这样，而是较模糊，较粗)；

2、两抗原孔抗原完全不相同；

3、两抗原部分相同。

原因：扩散中抗原抗体形成的沉淀线是半渗透性的屏障，游离的抗原抗体各位于沉淀线的两侧，特异性抗原、抗体相遇结合形成的复合物沉淀于此线，而不对应的抗原抗体则可以自由通过此沉淀线。

五、示教实验

（一)火箭电泳(rocket electrophoresis)：是单向扩散与电泳技术相结合的一种方法。

原理：抗体与琼脂混合，制成琼脂板，然后打孔，在孔内加入待检抗原，然后电泳，待检抗原在电场作用下泳动，当与琼脂中抗体比例合适，形成沉淀线，随抗原的量减少，沉淀带越来越窄，因此形成锥行沉淀线。沉淀峰的高低与抗原的浓度成正比。

应用：可用于测定待检标本中抗原的含量。

（二)免疫电泳(immunoelectrophoresis)：双向扩散和电泳技术相结合。

原理 ：先将待测的可溶性抗原在琼脂板的小孔中电泳，样品中不同成分的分子量、所带电荷不同，因此电泳可使其分布于不同的位置。然后在琼脂板上与电泳平行的方向挖一横槽，加入相应的抗血清，抗原抗体同时作自由扩散，在比例合适处形成沉淀线，根据沉淀线的数量、位置、形态进行分析样品中成分和性质。（长槽内加的是针对各种抗原的混合抗体液。)

应用 分析抗原的组分，鉴定提取物浓度

特点 样品用量少，特异性高，分辨力强等;

但如抗原中各组分含量悬殊时，不易全部显示，因此敏感性略差

实验三 补体溶血实验

实验性质：验证性

实验学时：2学时

学生分组人数：4-6人

一、实验目的：了解溶血反应的原理，掌握溶血反应的基本操作方法

二、实验原理：将绵羊红细胞做抗原注射家兔体内，经一定潜伏期，家兔血清中即出现特异

性抗体，此种抗体称溶血素，它可以与绵羊红细胞结合，此时若加入补体，即可激活补体的

经典途径，则呈现溶血现象。

三、实验材料

1、溶血素（1：1000)、补体（1：30)、绵羊红细胞（1%)、生理盐水

2、试管、吸管、试管架等

 四、实验方法

1、按下表将试管4支排成一排，

2、震荡混匀，37℃水浴30分钟。

五、实验结果

实验管因发生溶血而变红色透明，其余管为红细胞悬液。

六、注意事项

1、取样品的吸管不可混用；加样力求准确；

2、SRBC吹匀后再加；

3、补体稳定性差：T、pH、连续吹打等都使活性下降，所以置于冰浴中，用时再取；加入补体后轻轻吹打。

实验四 酶联免疫吸附实验(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)

实验性质：综合性

实验学时：3学时

学生分组人数：4-6人

一、实验目的：了解酶免疫标记技术的原理、种类和用途；熟悉和掌握用酶联免疫吸附试验检测抗原或抗体的原理。

二、实验原理：酶免疫测定是一种免疫标记技术，ELISA是将抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来,利用酶标记的抗原或抗体，在固相载体上进行抗原或抗体测定的方法。根据结合物中的酶作用底物后显色，有色产物的量与待测抗原或抗体的量成正比，根据颜色变化判断实验结果，也可以用酶标仪测定光密度（OD)值作定量测定抗原或抗体。

三、实验材料

双抗体夹心法检测乙肝表面抗原的试剂盒

四、实验方法 按照说明书分配包被抗体的固相载体

1.实验设计：每组8孔。设阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白对照1孔，其余为待检孔。

2.加样：各待检孔：分别加入50μL待检标本1、2、3

阳性对照：每孔加一滴阳性对照液

阴性对照：每孔加一滴阴性对照液

空白对照：什么也不加。（用酶标仪测定时调零用)

3．各孔加酶标抗体50μL，空白对照不加。水平快速震荡混匀1分钟，37℃水浴30分钟。

4．洗板：弃液 每孔加满洗液 30秒钟后甩去 拍干；重复4次。

5．显色：每孔加底物液A液、B液各一滴，37℃水浴15分钟。（此时为蓝色)。

6．终止反应：每孔加终止液一滴（从水浴取出时为蓝色，加入终止液后为黄色)。

7．观察结果： 目测：颜色深浅；酶标仪定量：测定OD值。

8、判定标准：待检标本测得OD值 ≥2.1 ×阴性对照OD值  （＋)；待检标本测得OD值 ＜2.1 ×阴性对照OD值  （－)；若阴性对照阴性对照OD值＜0.05，按0.05计算。

五、注意事项

1、待检标本为注射用疫苗，但仍需小心，不要弄到手上，若弄到手上应立即清洗。

2、37℃水浴时将各孔重新安装到架子上，盖膜，加入饭盒内，防止液体进入各孔。

3、弃液时，注意方向，不要让各孔之间的液体交叉。

4、拍干：倒置于卫生纸上，拍干，不要用纸伸入孔内吸液体。

5、底物液有毒，使用时小心。

6、实验结束，不要清洗板孔，直接将各板孔（包括液体)及试剂倒入垃圾中，切勿到处放置。

实验五 巨噬细胞吞噬试验

实验性质：综合性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

一、实验目的：了解巨噬细胞在非特异性免疫中的作用；观察巨噬细胞吞噬异物的形态。

二、实验原理：病原微生物、红细胞等异物侵入机体或在体外与巨噬细胞接触，巨噬细胞即进行吞噬。取细胞做涂片，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数，可估计巨噬细胞的功能。

三、实验材料

1、无菌生理盐水、鸡红细胞

2、无菌注射器、吸管、载玻片、解剖器械、蜡盘等

四、实验方法 每组一只小鼠（实验前已腹腔注射5%淀粉溶液诱导巨噬细胞入腹腔)

1、腹腔注射：酵母菌（真菌)或鸡红细胞1ml/mice，轻揉腹部，放置30分钟。（使巨噬细胞有足够的时间游走到腹腔并吞噬)

2、打开腹腔：拖颈处死小鼠，固定在蜡盘上；打开腹腔，注射生理盐水：2ml/mice（冲洗作用腹腔中的巨噬细胞)；吸管在腹腔两侧吸取腹腔液。

3、推片染色（瑞氏-吉姆萨染色)：

滴片 → 推片→自然干燥 →加染液一滴，混匀放置1分钟（染液为甲醇配置，甲醇可起固定作用，不需再固定)→加一滴蒸馏水混匀放置3~5分钟（稀释后的染料易使细胞着色)自来水缓冲，冲至无浮色（必在染液干之前冲，否则会有大量的小蓝点，即染料颗粒)    滤纸吸干玻片表面→ 镜检（油镜)。

4、观察：在高倍镜即可（鸡红细胞是一些淡黄色、椭圆形有核的细胞；而数量较多，较大的圆形或不规则的细胞，其表面具有许多似刺毛状的小突起(伪足)，即为巨噬细胞。慢慢移动玻片标本，仔细观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程。可见有的鸡红细胞(1-多个)紧附于巨噬细胞表面;有的巨噬细胞已将1~数个红细胞部分吞入;有的巨噬细胞已吞入1个或几个椭圆形的红细胞;有的巨噬细胞内的红细胞膜已被被消化，只看到红细胞核。)

实验六 外周血淋巴细胞分离

实验性质：验证性

实验学时：2学时

学生分组人数：4-6人

、实验目的：熟悉用密度梯度离心法的方法分离外周血淋巴细胞。

二、实验原理：密度梯度离心法，根据外周血中PBMC比重与血液中其他成分比重不同，采用分离液分离淋巴细胞。本实验用比重为1.077的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液（此为人外周血淋巴细胞分离液，分离豚鼠外周血也可以)。红细胞和粒细胞比重最大，沉于分离液的下层；分离液比重稍高于淋巴细胞，所以PBMC在分离液上层；血浆和血小板密度最低，悬浮在最上层。

三、实验材料 

1、聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液

2、肝素抗凝血、Hank^,s液

3、离心管、离心机、吸管、试管架

四、实验方法

1、抗凝取血：豚鼠心脏取血2ml（能多取可以多取，可直接抽血致死)

肝素抗凝：针管中吸0.1—0.2 ml，并推拉针芯润湿管壁，再推出少许使针头充满肝素

固定豚鼠：一手把两个前爪压在颈后，另一只手抓住两后肢，把身体伸平，暴露胸部。

抽血：另一人用手指将心脏推向左侧，大拇指找到心跳最强点（剑突上第4肋处)，肋间进针，边扎边抽，以免扎的过深或过浅。

2、等倍稀释：2 mlHank’s液＋2 ml血液，吹吸混匀（目的：使血液不太粘稠，容易分离)

3、分离：先加入2 ml淋巴细胞分离液，再沿管壁缓慢加入4 ml已稀释血液

4、离心：配平后，2000转/分，离心20分钟。离心结束出现可见分层现象.。

5、用吸管吸取淋巴细胞。

五、注意事项

1、取血：固定好，针头不可左右晃动，以防划破心脏，若改变方向需要回到皮下再换方向；推入试管时，要取下针头，以免细胞破碎；

2、分离：先加分离液；分离液与未稀释血液1：1；加入稀释血液时，用滴管沿管壁缓慢加入，不要打散液面；

3、离心：天平调平――托盘调平――试管与套筒一起调平――转速由慢到快。

实验七 E玫瑰花环试验

实验性质：验证性

实验学时：2学时

学生分组人数：4-6人

一、实验目的：了解E花环形成的原理，学会用E玫瑰花环试验鉴定和计算T淋巴细胞的方法

二、实验原理 

常人外周血T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体，即E受体，（又称CD2)，是T细胞特有的表面标志。在体外一定条件下，T细胞能直接与绵羊红细胞结合，形成玫瑰花样细胞团，称为E玫瑰花环。可用于测定血液中T细胞数目，间接反映细胞免疫功能。

豚鼠的T细胞表面有兔红细胞受体。避免豚鼠心脏取血不够用，另取豚鼠胸腺（其中多为T细胞)做E玫瑰花试验。需用小豚鼠，因为老豚鼠的胸腺已脂肪化。

三、实验材料 

1、Hank^,s液、兔红细胞悬液、戊二醛溶液、甲紫染液

2、 吸管、载玻片、解剖器械、蜡盘

四、实验方法

1、取胸腺：处死豚鼠，仰卧位固定于腊盘，沿腹正中线剪开，可见气管两侧各有一蚕豆大小的胸腺（质稍韧，肉色。确证：在玻片上涂几下，加一滴甲紫，高倍镜下观察)。

2、研磨：铜网置于平皿中，取出胸腺置铜网上，在胸腺上滴加少量Hank’s液，用针芯轻轻研磨，使胸腺细胞通过铜网漏入液体中。

3、离心：吸取细胞悬液于离心管中， 1000转/分，离心10分钟，胸腺细胞沉积于管底。

4、调细胞浓度：弃上清，以Hank’s液调细胞浓度。

沉淀约0.1ml细胞压积+ 2.9mlHank’s液（混匀)——细胞浓度约为3×10⁶/ml。

5、成花：取0.5ml胸腺细胞悬液＋0.5ml 1%兔红细胞＋一滴小牛血清（保护细胞)，混匀， 500转/分 离心5分钟。

6、滴片：去少量上清，加一滴戊二醛（固定作用，防成花细胞分离)，轻轻晃动试管以剩余的上清悬起细胞。取一滴细胞悬液，滴玻片，加一滴甲紫，盖盖玻片，低倍镜找到视野，高倍镜观察。

五、实验结果

凡结合3个以上绵羊红细胞的T淋巴细胞为E花环阳性细胞。记数200个淋巴细胞中形成E花环的淋巴细胞百分率，正常值为60%-80%。

六、注意事项

1、取胸腺：小心不要破坏血管，否则混淆视野；

2、研磨：不要干磨，也不要加液体过多。

3、成花后，以剩余上清重悬细胞动作要轻柔，否则花环散开。

实验八 淋巴细胞转化实验

实验性质：验证性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

（一)实验目的：体外淋巴细胞增殖反应实验是检测淋巴细胞功能的实验方法。了解淋巴细胞转化的实验方法，掌握淋转实验结果的判断。

（二)实验原理 特异执业护士网性抗原、抗CD3、抗TCR等单抗、丝裂原等均可刺激T淋巴细胞活化增殖，可通过观察T细胞的活化增殖情况判断T细胞的功能是否正常，进而反映机体细胞免疫功能是否正常。特异性抗原只能激活对应的T细胞克隆，所以常用丝裂原，如植物血凝素和刀豆蛋白刺激T细胞，美洲商陆用于刺激B细胞。

T淋巴细胞活化以后，可转化成淋巴母细胞（P720：细胞体积变大，为一般淋巴细胞的3-4倍；胞浆丰富，有伪足样突起，嗜碱，核周围有一染色较浅的透明区，并有空泡；核膜清晰，染色质疏松，呈细网状，有时可见1~3个核仁。除典型母细胞外，尚可见到过渡型细胞，这些细胞有上述1~2个特点，如染色质疏松，有核仁，胞浆嗜碱，但体积不大)。

T淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫功能水平。

   ³H标记的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR)掺入法；

常用检测淋巴细胞转化的方法：    MTT法   

镜检法（观察细胞形态变化)

正常值：T细胞转化率为60-80%；偏低：50-60%；降低：＜50%

形态学计数法即镜检法（全血)：淋巴细胞受丝裂原刺激后，在转化为淋巴母细胞的过程中，细胞的形态、结构发生明显的改变，通过染色镜检，即可计算出淋巴细胞的转化率。

（三)实验方法：

1)  于无菌小瓶中加入肝素抗凝血0.3ml，1640培养液2.7ml，丝裂原0.1ml（最终浓度为25～50μg／ml)或NaCl对照液0.1ml，每种丝裂原及对照均设4瓶。（在超净台操作)；

2)  37⁰C温箱培养3天；

3)  将培养物摇匀，移入离心管内，1000 r／min离心10 min，弃上清。取沉淀细胞做推片，自然干燥后，加甲醇固定3～5min，低温保存。

4)  姬－瑞氏染色，先加染液1 min后，加等量pH6.9磷酸盐缓冲液稀释，继续染15～20min，自来水冲洗，吸干后油镜观察。

5)  形态结果：

成熟淋巴细胞：与外周血淋巴细胞形态一致，胞核的染色质密集，无核仁，胞浆少，清度嗜碱性。

过渡型淋巴细胞：比成熟淋巴细胞略大，染色质同样致密，但有明确的核仁1～2个，细胞将增多，染色偏深。

淋巴母细胞：细胞增大，形态不规则，核染色质疏松，核也增大，有明确的核仁1～3个，胞浆幅度增大，也可看到空泡。

   6)计数200个淋巴细胞，计算出淋巴细胞转化率

MTT比色法（单个核细胞)：四甲基偶氮唑蓝（MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成蓝黑色的甲臢，形成甲臢的量与细胞增殖程度呈正相关。因此通过测定细胞形成甲臢的量，可间接定量分析细胞的增殖情况。

取分离出的单个核细胞层，配成5×10⁶／ml，加3 ml，再加0.1ml丝裂原，加盐水对照，培养70h后，加10μlMTT，混匀后，培养4～6小时。细胞培养终止后，加酸化异丙醇0.1 ml，充分混匀，静置数分钟，按MTT比色法测OD值。

计算SI：SI＝试验孔的OD均值／对照孔的OD均值。

实验九 T亚群鉴定

实验性质：综合性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

一、人外周血淋巴细胞分离

实验方法：

1、取血2ml。

2、等倍稀释：2 mlHank’s液＋2ml血液，吹吸混匀。

3、分离：先加入2 ml淋巴细胞分离液，再沿管壁缓慢加入4ml已稀释血液。

4、离心： 2000转/分，离心20分钟。

5、吸取淋巴细胞，加入5倍体积Hank’s液洗涤，1500转/分，离心5分钟。

6、弃去上清，再加入5倍体积Hank’s液洗涤，1500转/分，离心5分钟。

7、倒掉上清，以回壁的上清重悬细胞，在划圈的玻片上滴片，吸起，快速冷风吹干，密封，收回。（分3组)

二、 T淋巴细胞亚群的检测

实验性质：验证性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

（一)实验目的：熟悉并掌握利用APAAP法对外周T淋巴细胞亚群检测的方法。

（二)实验原理：

T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群，在正常机体内各个淋巴细胞亚群相互作用，维持机体正常的免疫功能。T淋巴细胞亚群的分类方法中最常用的是根据表面标志，利用单克隆抗体将其分为不同功能亚群。本试验利用单克隆抗体APAAP法试剂盒检测T淋巴细胞亚群。

APAAP法即“碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶”桥联酶染色法,是一项免疫组化技术：将鼠源的抗人T细胞亚群CD单抗与人T细胞结合，再用羊抗鼠的单抗起桥连作用：一个Fab段连接抗人T细胞单抗 一个Fab段连接APAAP复合物再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断CD分子的存在，确定T细胞各亚群的数目。（如下图)

一抗：鼠抗人T淋巴细胞的单抗（与待测抗原结合)；

二抗：山羊抗鼠球蛋白的单抗（起桥联用)一个Fab段连接一抗，

一个Fab段连接APAAP复合物；

三抗（APAAP复合物)：鼠抗碱性磷酸酶的单抗和碱性磷酸酶形成的免疫复合物

三、实验材料

1、划圈笔、玻片、封口袋

2、固定液、底物液、坚固红、复染液、生理盐水(NS)、PBS

3、鼠抗人T亚群单克隆抗体：抗CD3⁺单抗、抗CD4⁺单抗、抗CD8⁺单抗

4、抗鼠IgG二抗

5、APAAP复合物

四、实验方法

1、标本制备：从外周血中用密度梯度离心法分离单个核细胞，用NS洗涤细胞3次。取细胞悬液滴于玻片，再吸取液滴，剩一薄层细胞，快速冷风吹干，如不立即染色，封口袋密封，-20℃保存。（已完成)

2、固定：滴一滴固定液于标本上，固定2分钟，PBS洗3次，甩弃多余PBS，滤纸吸干。

3、加一抗：分别加鼠抗人T细胞CD3、CD4、CD8单抗10μl，放湿盒37℃水浴温育25分钟，PBS洗3次，甩弃多余PBS，滤纸吸干。

4、加二抗：羊抗鼠IgG二抗10μl，放湿盒37℃水浴温育25分钟，PBS洗3次，甩弃多余PBS，吸干。

5、加APAAP复合物：10μl，放湿盒37℃水浴温育25分钟，PBS洗3次，甩弃多余PBS，滤纸吸干。

6、显色：滴加底物液（底物液1ml+坚固红1mg，混匀，充分溶解)20μl，放湿盒37℃水浴温育15分钟，自来水冲洗终止显色。

7、复染：苏木素复染液1滴，染色1分钟，自来水洗。

8、结果观察：高倍镜下，细胞核为蓝色，细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞，计数100－200个单个核细胞，计算阳性细胞百分率。

思考题

1、T细胞亚群的检测有何意义？

2、其他检测T细胞亚群的方法有哪些？

实验十 免疫血清的制备与检测

实验性质：综合性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

实验要求：

根据已学过的知识，自行设计免疫血清的制备和检验程序(包括实验材料、实验方法)并进行检测。

实验项目：动物免疫，血清中抗体的检测。

免疫血清的制备  免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素，应予重视。

一、原理　具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。

二、免疫方法　根据抗原的性质不同而异，我们制备小鼠抗羊RBC的抗体采用的是腹腔注射免疫。

三、实验步骤：

1、  免疫小鼠：7天前（一般为5天，因为我们的实验课一周一次)免疫小鼠（2%羊红细胞0.2ml腹腔注射)；

2、  取外周血：摘除眼球取血于离心管内（一只小鼠用此法一般可收集1毫升血，每1毫升血可分离出0.3-0.4毫升的血清)。

3、  分离血清：血液室温放置1小时后，分离血清，离心血清，1500转/分，10-15分钟（因为血清量少，不离心吸取血清时易吸上RBC。同时离心也可去除血清中的丝状物)，取出血清，-20℃保存；（以下下节课做)

4、  溶血素活性测定：将受检血清在试管内等倍稀释，加入定量补体和羊红细胞，孵育后观察试管中的溶血反应，评价待检血清中的抗体活性。（类似试管凝集反应)

⑴ 稀释血清：从冰箱中取出血清，室温放置至血清融化。血清用pBS缓冲液稀释300倍，吹打混匀；

⑵  加液：取1ml稀释后的血清，加入10%SRBC 0.5ml，补体1ml，对照管用缓冲液代替血清；

⑶  孵育：37℃恒温水浴15-30分钟，冰浴终止反应；

⑷ 测量结果：离心，2000转/分钟，10min，取上清1ml，都氏试剂（内含氢化物，可破坏RBC，以防止上清中混有的RBC影响检测结果)3ml加于测试板中，混匀，酶标仪540nm测吸光度值。

实验十一 体液免疫检测

实验性质：设计性

实验学时：4学时

学生分组人数：4-6人

实验要求：

要求学生自行设计检验程序(包括实验材料、实验方法)并进行检测。

实验项目：

1、用已知抗体鉴定未知细菌；

2、用已知抗原检测双份血清中的抗体效价；

实验十二 小鼠细胞免疫功能的检测

实验性质：开放性

实验学时：4学时

学生分组人数：随机

实验要求：小鼠细胞免疫功能分为固有免疫和适应性免疫两大类，包括吞噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等学生在所学知识的基础上，结合实验室具备的条件，设计出可行的实验方法，可以检测细胞数量，也可以检测细胞功能，全面考察小鼠的细胞免疫功能。

实验项目：自选

说明：本次实验学生还可以根据自己的兴趣选择有关的实验，教研室全力支持。

附录（综合和设计性实验参考)

多克隆抗体的制备

抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性球蛋白。是免疫应答的重要产物，亦是免疫学实验中常用的试剂，对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学诊断中应用极为广泛。目前人工制备的特异性抗体分为三种类型，即多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。多克隆抗体的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素，应予重视。

  一、免疫动物

  （一)动物的选择

  供免疫的动物有哺乳类和禽类，常选用家兔、山羊或绵羊、马、骡和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的特性和所要获得的抗体的量和用途。

（二)抗原及抗原计量的选择

不同抗原的免疫原性强弱不一，这取决于其分子量、化学活性基团、立体结构、物理性状和弥散速度等。抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、免疫次数、注射途径以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。

（三)免疫方案

 抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔等不同途径注入抗原进行免疫。以颗粒性抗原免疫小鼠为例，具体方案如下：

1.主要材料：健康昆明小鼠数只；2%羊红细胞悬液

2.免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2ml 2%羊红细胞悬液。7天后取外周血：摘除眼球取血于离心管内（一只小鼠用此法一般可收集1毫升血，每1毫升血可分离出0.3-0.4毫升的血清)。分离血清：血液室温放置1小时后，分离血清，离心血清，1500转/分，10-15分钟（因为血清量少，不离心吸取血清时易吸上RBC。同时离心也可去除血清中的丝状物)，取出血清，如不立即鉴定，-20℃保存

3.抗血清的鉴定：溶血素活性测定：将受检血清在试管内等倍稀释，加入定量补体和羊红细胞，孵育后观察试管中的溶血反应，评价待检血清中的抗体活性。

⑴ 稀释血清：从冰箱中取出血清，室温放置至血清融化。血清用pBS缓冲液稀释300倍，吹打混匀；

⑷  加液：取1ml稀释后的血清，加入10%SRBC 0.5ml，补体1ml，对照管用缓冲液代替血清；

⑸  孵育：37℃恒温水浴15-30分钟，冰浴终止反应；

⑷ 测量结果：离心，2000转/分钟，10min，取上清1ml，都氏试剂（内含氢化物，可破坏RBC，以防止上清中混有的RBC影响检测结果)3ml加于测试板中，混匀，酶标仪540nm测吸光度值。计算血清中抗体的效价。

附表

河北医科大学设计（综合)性实验开题报告