药学的生物化学-教材建设:核酸的化学

第四章  核酸的化学

第一节  核酸的概念和化学组成

核酸(nucleic acid)是含有磷酸基团的重要生物大分子，因最初从细胞核分离获得，又具有酸性，故称为核酸。一切生物都含有核酸，即使比细菌还小的病毒也含有核酸。所以凡是有生命的地方就有核酸存在。

核酸具有非常重要的生物学意义，不仅与正常生命活动如生长繁殖、遗传变异、细胞分化等有着密切关系，而且与生命的异常活动如肿瘤发生、辐射损伤、遗传病、代谢病、病毒感染等也息息相关。因此核酸研究是现代生物化学、分子生物学与医药学发展的重要领域。

一、 核酸的概念和重要性

核酸在细胞内通常以与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。天然的核酸分为两大类，即核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。DNA主要分布在细胞核中，RNA可存在于细胞质和细胞核中。DNA是生物遗传变异的物质基础。RNA在细胞中的含量比DNA高。原核细胞和真核细胞都含有三种主要RNA：信使RNA(mRNA)，核蛋白体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。真核细胞还含有核不均RNA(HnRNA)和核小RNA(SnRNA)。HnRNA是mRNA的前体物，SnRNA参与RNA的修饰加工和对细胞与基因行为的调控，是一类新的核酸调控分子。

(一) 核酸是遗传变异的物质基础

遗传与变异是最重要、最本质的生命现象。遗传是相对的，有了遗传的特征才保持物种的相对稳定性。变异是绝对的，有变异才有物种的进化和生物发展的可能。生物遗传特征的延续与生物进化都是由基因所决定的。基因特征是由DNA分子中的特定核苷酸种类、数目和排列顺序所决定的，一个基因(gene)系指含有合成一个功能性生物分子(蛋白质或RNA)所需信息的一个特定DNA片段，所以说核酸是遗传变异的物质基础。利用DNA人工重组技术，可以使一种生物的DNA或片段(基因)引入另一种生物体内，而后者则能表现前者的生物性状，从而实现了超越生物种间的基因转移，并表现出被转移基因的生物学功能。

(二) 核酸与生物遗传信息的传递

生物遗传信息贮存在DNA分子上，但生物性状并不由DNA直接表现，而是通过各种蛋白质的生物功能才表现出来。蛋白质的结构是由DNA决定的，也就是说遗传信息是由DNA传向蛋白质的。遗传信息的这种传递不是直接的，而是通过中间信使，即DNA的副本mRNA来传递的，即DNA把自己的信息先传给mRNA，然后再由mRNA传给蛋白质。所以蛋白质的生物合成和生物性状的表现(如新陈代谢、生长发育、组织分化等)都直接与核酸紧密相关。

(三) 核酸与医药

由于DNA是遗传信息的载体，因此，DNA分子结构的改变，必将导致生物功能的改变。如病毒的致病作用，恶性肿瘤、放射病及遗传性疾病、代谢病、辐射损伤等都与核酸功能的变化密切相关。病毒主要是由蛋白质和核酸组成的，因此核酸类衍生物可作为抗病毒药物，如5-碘尿苷(5-碘脱氧嘧啶核苷)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、阿糖腺苷(腺嘌呤阿拉伯糖苷)等。还有多种双股多聚核苷酸，如多聚肌苷酸；多聚胞苷酸(poly Ⅰ：C)，可诱导体内产生干扰素，保护细胞免受病毒感染，具有防治病毒性疾病的疗效。

许多抗癌药物属于核苷或核酸类衍生物，如治疗消化道癌症5-氟尿嘧啶，治疗白血病的6-巯基嘌呤等。抗癌和抗病毒药物的作用是抑制病原核酸与蛋白质的合成，从而抑制了癌细胞与病毒的进一步增殖，因此抗癌、抗病毒药物的作用机制与新药合成研究都与核酸化学关系密切。

基因工程技术正在改变医药工业的传统生产方式，已有许多基因工程药物研究成功并投入临床应用，如人胰岛素、人生长素、α-干扰素、乙肝疫苗、人白介素-2等，这不仅满足了医疗需要，而且将对医药产品结构的更新换代产生重大影响。另外，应用基因技术，还可能把遗传病病人所缺乏的基因导进体内，使其体细胞重新具有所缺陷的基因，表达所需要的蛋白进行基因治疗。

应用转基因技术、构建转基因动物，将成为未来生物药物的一种新生产手段。因此核酸的研究与应用对医疗卫生和工农业生产极为重要，是战胜疾病、开发新药、创造新物种与新品种的有效手段。

二、 核酸的基本结构单位——单核苷酸

核酸是一种多核苷酸(Polynucleotide)，它的基本结构单位是单核苷酸(mononucleotide)。核苷酸还可以进一步分解成核苷(nucleoside)和磷酸。核苷再进一步分解成碱基(base)(嘌呤碱与嘧啶碱)和戊糖(pentose)。戊糖有两种：D-核糖(D-ribose)和D-2-脱氧核糖(D-2-deoxyribose)，据此将核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸。

RNA主要由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四种碱基组成的核糖核苷酸构成。DNA主要由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶四种碱基组成的脱氧核糖核苷酸组成。RNA和DNA分子中三种碱基是相同的，只有一种碱基不同，RNA分子中是尿嘧啶，而DNA分子中是胸腺嘧啶。RNA和DNA的基本化学组成见表4-1。

表4-1  DNA和RNA的基本化学组成

*粗黑体字示DNA和RNA基本化学组成的不同处。

(一) 核苷和核苷酸

1. 碱基 核酸中的碱基分两类：嘧啶碱和嘌呤碱。

(1)嘧啶碱：核酸中常见的嘧啶碱有三类：胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。DNA和RNA中都含有胞嘧啶，RNA还含有尿嘧啶，DNA还含有胸腺嘧啶。此外，小麦胚DNA含有5-甲基胸嘧啶，某些噬菌体中含有5-羟甲基胞嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶等。

嘧啶 胞嘧啶 尿嘧啶胸腺嘧啶

5-甲基胞嘧啶5-羟甲基胞嘧啶  5-羟甲基尿嘧啶

(2)嘌呤碱：核酸中所含的嘌呤碱主要有腺嘌呤和鸟嘌呤。

嘌呤 腺嘌呤  鸟嘌呤

 (3)稀有碱基：除表4-1所列核酸中五种基本的碱基外，核酸中还有一些含量甚少的碱基，称为稀有碱基。很多稀有碱基是甲基化碱基。如1-甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤和次黄嘌呤、二氢尿嘧啶等。

1-甲基腺嘌呤 1-甲基鸟嘌呤

（1-methyladenine) (1-methylquanine)

次黄嘌呤 1-甲基次黄嘌呤  二氢尿嘧啶

(hypoxanthine)  (1-methylhypoxanthine)  (dihydrouracil)

2. 核糖和脱氧核糖 RNA和DNA两类核酸是因所含戊糖不同而分类的。RNA含β-D-核糖，DNA含β-D-2脱氧核糖。某些RNA中含有少量β-D-2-O-甲基核糖。核酸分子中的戊糖都是β-D-型。

β-D-核糖 β-D-2-脱氧核糖β-D-2-O-甲基核糖

3. 核苷 戊糖和碱基缩合而成的糖苷称为核苷(nucleoside)。戊糖和碱基之间的连接是戊糖的第一位碳原子(C₁)与嘧啶碱的第一位氮原子(N₁)或嘌呤碱的第九位氮原子(N₉)相连接。戊糖和碱基之间的连接键是N—C键，一般称为N-糖苷键。

核苷中的D-核糖和D-2-脱氧核糖都是呋喃型环状结构。糖环中的C₁是不对称碳原子，所以有α和β两种构型。核酸分子中的糖苷键均为β-糖苷键。

应用X-射线衍射法证明，核苷中的碱基与糖环平面互相垂直。

根据核苷中所含戊糖不同，将核苷分为核糖核苷和脱氧核糖苷两类。

在核苷的编号中，糖的编号数字上加一撇，以便与碱基编号区别。对核苷进行命名时，先冠以碱基的名称，如腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷等。

RNA中主要的核糖核苷有四种：腺嘌呤核苷(adenosine,A)、鸟嘌呤核苷(guanosine,G)、胞嘧啶核苷(cytidine,C)和尿嘧啶核苷(uridine,U)。其结构式如下：

腺嘌呤核苷鸟嘌呤核苷胞嘧啶核苷  尿嘧啶核苷

（腺苷)        （鸟苷)   （胞苷) （尿苷)

DNA中主要的脱氧核糖核苷也有四种：腺嘌呤脱氧核苷(deoxyadenosine,dA)、鸟嘌呤脱氧核苷(deoxyguanosine,dG)、胞嘧啶脱氧核苷(deoxycytidine,dC)、胸腺嘧啶脱氧核苷(deoxythymidine,dT)。其结构式如下：

腺嘌呤脱氧核苷  鸟嘌呤脱氧核苷 胞嘧啶脱氧核苷  尿嘧啶脱氧核苷

（脱氧腺苷)       （脱氧鸟苷)  （脱氧胞苷)      （脱氧胸苷)

tRNA中含有少量假尿嘧啶核苷(pseudouridine)，其结构特殊，它的核糖不是与尿嘧啶的N₁相连接，而是与嘧啶环的C₅相连接，结构式如下：

假尿嘧啶核苷

4. 核苷酸 核苷中戊糖的羟基磷酸酯化，就形成核苷酸(nucleotide)。即核苷酸是核苷的磷酸酯。根据核苷酸中的戊糖不同，核苷酸可分为两大类：核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。核苷酸是构成核酸分子的基本结构单位。由于核糖中有三个游离的羟基(2"，3"和5")，因此核糖核苷酸有2"-核苷酸、3"-核苷酸和5"-核苷酸三种。而脱氧核糖只有3"和5"两个游离羟基可被酯化，因此只有3"-脱氧核苷酸和5"-脱氧核苷酸两种。自然界存在的游离核苷酸为5"-核苷酸，一般其代号可略去5"。

5’-腺嘌呤核苷酸  3’-腺嘌呤核苷酸

（5’-AMP)(3’-AMP)

5’-胞嘧啶脱氧核苷酸 3’-胞嘧啶脱氧核苷酸

（5’-dCMP)(3’-dCMP)

表4-2  RNA和DNA的基本结构单位

核酸(RNA和DNA)是由许多核苷酸分子以3",5"-磷酸二酯键互相连接而组成的多核苷酸。RNA和DNA的基本结构单位如表4-2。

(二) 环化核苷酸

环化核苷酸如环化腺苷酸和环化鸟苷酸普遍存在于动植物和微生物细胞中。它们的结构式如下：

3"，5"-环腺苷酸 3"，5"-环鸟苷酸

3"，5"-环腺苷酸(3,5-cyclicadenylic acid)或称环腺-磷(cAMP)。3"，5"-环鸟苷酸(3，5-cyclic guanylic acid)或称环鸟-磷(cGMP)。

环化核苷酸参与调节细胞生理生化过程，控制生物的生长、分化和细胞对激素的效应。cAMP和cGMP分别具有放大激素作用信号和缩小激素作用信号的功能，因此称为激素的第二信使。cAMP还参与大肠杆菌中DNA转录的调控。

外源cAMP不易通过细胞膜，cAMP的衍生物双丁酰cAMP可通过细胞膜，已应用于临床，对心绞痛、心肌梗塞症等有一定疗效。

(三)辅酶类核苷酸

许多辅酶是核苷酸类衍生物，简述如下：

1. 辅酶Ⅰ(CoⅠ，NAD)和辅酶Ⅱ(CoⅡ,NADP)  辅酶Ⅰ(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和辅酶Ⅱ(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)都是二核苷酸，即由两个单核苷酸组成，一个单核苷酸含有的碱基是腺嘌呤，另一个核苷酸的碱基是尼克酰胺(维生素PP)。其组成简示如下：

辅酶I（NAD) 辅酶II（NADP)

辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ都是脱氢酶的辅酶，其结构中的尼克酰胺部分能可逆地加氢与脱氢，在生物氧化中起递氢作用。

2. 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)  FAD的组成简示如下：

可见FAD是类似二核苷酸的化合物，其分子中一半是腺嘌呤核苷酸，另一半是磷酸核黄素，又称黄素单核苷酸(FMN)，其结构式与核苷酸类似。FAD和FMN的主要功能是在生物氧化过程中起传递氢原子的作用。

3. 辅酶A(CoA，CoA-SH)  辅酶A是核苷酸衍生物，结构中含有腺嘌呤核苷酸，其组成简示如下：

辅酶A分子中的泛酸是一种水溶性维生素，而氨基乙硫醇(H₂N—CH₂—CH₂—SH)结构中的巯基(—SH)是辅酶A参与酶促反应的一个重要基团，因此，辅酶A常用CoA-SH表示。

辅酶A参与糖、脂肪、蛋白质代谢，尤其对脂肪代谢的促进作用更加重要。辅酶A已应用于冠状动脉粥样硬化的防治。

第二节 核酸的分子结构

一、DNA的分子结构

(一) DNA的一级结构

核酸是由许多分子单核苷酸构成的。核酸的一级结构是指构成核酸的各个单核苷酸之间连接键的性质以及组成中单核苷酸的数目和排列顺序(碱基排列顺序)。

实验表明，核酸中核苷酸和核苷酸之间通过3"，5"-磷酸二酯键连接。即它们的连接方式是：一个核苷酸的脱氧核糖的第5"位碳原子(C₅")上的磷酸基与相邻的核苷酸的脱氧核糖的第3"位碳原子(C₃")上的羟基结合。后者分子中的C₅上的磷酸基又可与另一个核苷酸分子C₃"上的羟基结合。如此通过3"，5"-磷酸二酯键将许多核苷酸连接在一起，形成多核苷酸链。DNA是由数量极其庞大的四种脱氧核糖核苷酸，通过3"，5"-磷酸二酯键彼此连接起来的直线形或环形分子，DNA没有侧链。图4-1表示DNA多核苷键链的一个小片段。

图4-1  DNA分子中多核苷酸链的一个小片段及缩写符号

A：DNA多核苷酸链的一个小片段；B：为线条式缩写；C：为文字式缩写

图4-1的右侧是多核苷酸的两种缩写法。B为线条式缩写，竖线表示核糖的碳链，A、C、T、G表示不同的碱基，P和斜线代表3",5"-磷酸二酯键。C为文字式缩写，其中P表示磷酸基团，当P写在碱基符号左边时，表示P在C₅"上，而P写在碱基符号右边时，则表示P与C₃"相连。有时多核苷酸中的磷酸二酯键的P也被省略，如写成---pA-C-T-G…或pACTG。各种简化式的读向是从左到右，所表示的碱基序列是从5"到3"。

不同的DNA的核苷酸数目和排列顺序不同，生物的遗传信息就储存记录于DNA的核苷酸序列中。测定DNA的核苷酸序列，也即测定DNA的一级结构，近几年来已取得重大突破，如大肠杆菌DNA、果蝇DNA、小鼠DNA和人类DNA等的一级结构测序工作均已完成。

(二) 真核细胞染色质DNA与原核生物DNA的一级结构特点

真核细胞染色质由DNA、组蛋白、非组蛋白和RNA组成。其中DNA分子量很大，它是遗传信息的载体。与原核细胞染色质DNA比较在一级结构上真核细胞DNA具有以下显著特点：

1. 重复顺序 真核细胞染色质DNA具有许多重复排列的核苷酸序列，称为重复顺序。按重复程度不同可分为高度重复顺序，中度重复顺序和单一顺序三种。

(1)高度重复顺序：许多真核细胞染色质DNA都含有高度重复顺序。这种重复顺序结构的“基础顺序”短，含5～100bp，重复次数可高达几百万次(10⁶～10⁷)。高度重复顺序结构中G—C含量高，进行CsCl梯度离心时常在DNA主峰旁显示一个或多个小峰，这些小峰称为卫星峰，这部分DNA又称为卫星DNA。这种DNA的GC含量一般少于主带中的DNA。浮力密度也低。

(2)中度重复顺序：这种结构的“基础顺序”长，可达300bp，或更长，重复次数从几百到几千不等。组蛋白基因，rRNA基因(rDNA)及tRNA基因(tDNA)大多数为中度重复顺序。

(3)单一顺序：又称单拷贝顺序，真核细胞中，除组蛋白外，其他所有蛋白质都是由DNA中单一序列决定的。每一序列片段决定一个蛋白质结构，为一个蛋白质的结构基因。迄今为止，在真核生物中还没有发现一个蛋白质基因是多顺反子结构的。

2. 间隔顺序与插入顺序 在真核细胞DNA分子中，除了编码蛋白质和RNA的基因序列片段外，还有一些片段不编码任何蛋白质和RNA，它们可以存在于基因与基因之间，也可以存在于基因之内。前者称为间隔顺序，后者称为插入顺序。在许多DNA分子中，常常含有长短不一的间隔顺序，也常常出现一些插入顺序将一个基因分成几段，如鸡卵清蛋白基因，珠蛋白基因都含有插入顺序。通常把基因内的插入顺序称为内含子(intron)，把编码蛋白质的基因顺序称为外显子(exon)。

3. 回文结构 在真核细胞DNA分子中，还存在许多特殊的序列。这种结构中脱氧核苷酸的排列在DNA两条链中的顺读与倒读意义是一样的(即脱氧核苷酸排列顺序相同)，脱氧核苷酸以一个假想的轴成为180°旋转对称(即使轴旋转180°两部分结构完全重合)，这种结构称为回文结构。如下图所示：

对称轴

原核生物DNA顺序组织具有以下不同特点：

1. 原核生物在DNA顺序组织上的最大特点是基因重叠，如病毒DNA分子一般都不大，但又必须装入相当多的基因，因此可能在这种压力下导致病毒DNA在进化过程中重叠起来。也就是说在同一DNA序列中，常包括不同的基因区，这些重叠在一起的基因，使用的编码组序不同，因此虽然是同样的DNA顺序区段内，都可翻译出不同的蛋白质。如在噬菌体ΦX174中，基因B和基因K重叠在基因A之内。由下图可见在同一部分核苷酸顺序片段中，它们在三个编码组之中，含义各不相同。

由于基因的重叠，在重叠部位一个碱基的突变将影响二个或三个蛋白质的表达。

2. 在原核生物的DNA顺序组织中，每个转录的mRNA常常包含了多个顺反子，而且功能上有关的顺反子通常串联在一个mRNA分子上。这些编码在同一个mRNA分子中的多种功能蛋白在生理功能上都是密切相关的。这种DNA顺序组织可能是原核基因协同表达的一种调控方式。如ΦX174噬菌体DNA序列，从启动子P_O开始转录的mRNA包含了基因D—(E)—J—F—G—H。其中基因J、F、G、H都是编码噬菌体的外壳蛋白。因此原核生物DNA顺序的另一个特点是功能上相关的结构基因转录在同一个mRNA分子上。

3. 原核生物DNA顺序所含有的结构基因是连续的，一般不含有插入或间隔序列，而且在转录调控区的DNA顺序的组织形式是多种多样的，调控区的不同组织形式与不同的生物功能有明显关系。

(三) DNA的二级结构

1. DNA二级结构的Watson-Crick模型 DNA双螺旋结构模型是Watson和Crick在前人的工作基础上于1953年提出来的(图4-2)。根据此模型，结晶的B型DNA钠盐是由两条反向平行的多核苷酸链，围绕同一个中心轴构成的双螺旋结构。

DNA双螺旋结构模型的要点：

(1) DNA分子由两条脱氧多核苷酸链构成，两条链都是右手螺旋，这两条链反向平行(即一条为5"→3"，另一条为3"→5"，围绕同一个中心轴构成双螺旋结构)。链之间的螺旋形成一条大沟和一条小沟。多核苷酸链的方向取决于核苷酸间的磷酸二酯键的走向(图4-3)。

图4-2  右手螺旋DNA双螺旋结构（二级结构)模型（a)及其图解(b)

图4-3  DNA分子中多核苷酸链的方向

(2) 磷酸基和脱氧核糖在外侧，彼此之间通过磷酸二酯键相连接，形成DNA的骨架。碱基连接在糖环的内侧。糖环平面与碱基平面相互垂直。

(3) 双螺旋的直径为2nm。顺轴方向，每隔0.34nm有一个核苷酸，两个相邻核苷酸之间的夹解为36°。每一圈双螺旋有10对核苷酸，每圈高度为3.4nm。

(4) 两条链由碱基间的氢键相连，而且碱基间形成氢键有一定规律：腺嘌呤与胸腺嘧啶成对，鸟嘌呤与胞嘧啶成对。A和T间形成两个氢键，G和C间形成三个氢键。这种碱基之间互相配对称为碱基互补(图4-4)。

图4-4  DNA分子中的A=T，G≡C配对（长度单位为nm)

因此，当一条多核苷酸链的碱基序列已确定，就可推知另一条互补核苷酸链的碱基序列。每种生物的DNA都有其自己特异的碱基序列。

(5) 沿螺旋轴方向观察，配对的碱基并不充满双螺旋的全部空间。由于碱基对的方向性，使www.med126.com/kuaiji/得碱基对占据的空间不对称，因此在双螺旋的表面形成两个凹下去的槽，一个槽大些，另一个槽小些，分别称为大沟和小沟。双螺旋表面的沟对DNA和蛋白质相互识别是很重要的。

DNA双螺旋结构的稳定因素：

DNA双螺旋结构是很稳定的。主要有三种作用力使DNA双螺旋结构维持稳定。一种作用力是互补碱基之间的氢键，但氢键并不是DNA双螺旋结构稳定的主要作用力，因为氢键的能量很小。DNA分子中碱基的堆积可以使碱基缔合，这种力称为碱基堆积力，是使DNA双螺旋结构稳定的主要作用力。碱基堆积力是由于杂环碱基的π电子之间相互作用所引起的。DNA分子中碱基层层堆积，在DNA分子内部形成一个疏水核心。疏水核心内几乎没有游离的水分子，这有利于互补碱基间形成氢键。第三种使DNA分子稳定的力是磷酸基的负电荷与介质中的阳离子的正电荷之间形成的离子键。它可以减少DNA分子双链间的静电斥力，因而对DNA双螺旋结构也有一定的稳定作用。与DNA结合的阳离子如Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺，在细胞中很多。此外，在原核细胞中DNA常与精胺或亚精胺结合，真核细胞中的DNA一般与组蛋白结合。

天然DNA在不同湿度、不同盐溶液中结晶，其X线衍射所得数据不一样，因而M.Wilkins等将DNA的二级结构分为A、B、C三种不同的类型(表4-3)。Watson和Crick提出的结构为B型，溶液和细胞中天然状态的DNA可能是B型。

表4-3  DNA的类型

因DNA纤维的含水量不同，而形成三种不同的DNA构象。A型DNA是相对湿度为75%时制成的DNA钠盐纤维，也是右手螺旋。它与B型DNA不同之处是碱基不与纵轴相垂直，而呈20°倾角，所以螺距与每圈螺旋的碱基数目发生了改变。A型DNA的螺距不是3.4nm，而是2.8nm，所以每圈螺旋含有11个碱基对。当DNA纤维中的水分再减少时，就出现C型，C型DNA可能存在于染色体和某些病毒的DNA中。

2. 左手螺旋DNA 1979年，美国麻省理工学院A.Rich等从d(GCGCGC)这样一个脱氧六核苷酸X线衍射结果发现，该片段以左手螺旋存在于晶体中，并提出了左手螺旋的Z-DNA模型。

Watson和Crick右手螺旋DNA模型是平滑旋转的梯形螺旋结构，而新发现的左手螺旋DNA，虽也是双股螺旋，但旋转方向与它相反，主链中磷原子连接线呈锯齿形(zigzag)，如似Z字形扭曲，因此称为Z-DNA。Z-DNA直径约1.8nm，螺距4.5nm，每一圈螺旋含12个碱基对，整个分子比较细长而伸展。Z-DNA的碱基对偏离中心轴并靠近螺旋外侧，螺旋的表面只有小沟没有大沟。此外，许多数据均与B-DNA不同(表4-4)。

表4-4  B-DNA与Z-DNA的比较

Rich提出的左旋DNA模型虽然来自人工合成的脱氧六核苷酸的实验结果，但20世纪80年代以来一些学者在多种实验基础上，指出左旋DNA也是天然DNA的一种构象，而且在一定条件下右旋DNA可转变为左旋，并提出DNA的左旋化可能与致癌、突变及基因表达的调控等重要生物功能有关。

(四) DNA的三级结构

在DNA双螺旋二级结构基础上，双螺旋的扭曲或再次螺旋就构成了DNA的三级结构。超螺旋是DNA三级结构的一种形式。超螺旋的形成与分子能量状态有关。

在DNA双螺旋中，每10个核苷酸旋转一圈，这时双螺旋处于最低的能量状态。如果使正常的双螺旋DNA分子额外地多转几圈或少转几圈，这就会使双螺旋内的原子偏离正常位置。对应在双螺旋分子中就存在额外张力。如果双螺旋末端是开放的，这种张力可以通过键的转动而释放出来，DNA将恢复到正常的双螺旋状态。如果DNA两端是以某种方式固定的，或是成环状DNA分子，这些额外的张力不能释放到分子之外，而只能在DNA内部使原子的位置重排，这样DNA本身就会扭曲，这种扭曲就称为超螺旋。环状DNA都是超螺旋。如果将这种超螺旋用DNA内切酶使其切断一条链，螺旋反转形成的张力释放，超螺旋则能恢复到低能的松驰状态(图4-5)。超螺旋DNA的体积比环状松弛状DNA更紧缩。已发现大肠杆菌DNA可形成许多小环，并通过蛋白质连接在一起。每一个小环又形成超螺旋。形成小环和超螺旋使很大的环状DNA分子能够压缩成很小的体积而不需要包膜来帮助。

(五) 染色质与染色体

DNA的三级结构与其结合的蛋白质有关。具有三级结构的DNA和组蛋白紧密结合组成染色质。构成真核细胞的染色体物质称为“染色质”(chromatin)，它们是不定形的，几乎是随机地分散于整个细胞核中，当细胞准备有丝分裂时，染色质凝集，并组装成因物种不同而数目和形状特异的染色体(chromosome)，此时当细胞被染色后，用光学显微镜可以观察到细胞核中有一种密度很高的着色实体。因此真核染色体只限于定义体细胞有丝分裂期间这种特定形状的实体。所以“染色体”是细胞有丝分裂期间“染色质”的凝集物。

真核细胞染色质中，双链DNA是线状长链，以核小体(nucleosome)的形式串联存在。核小体是由组蛋白H₂A，H₂B，H₃和H₄各两分子组成的八聚体，外绕DNA，长约145碱基对，形成所谓的核心颗粒(core particle)，实际上需再由组蛋白H₁与DNA两端连接(图4-6)，使DNA围成两圈左手超螺旋，共约166碱基对。与组蛋白皆以盐键相联，形成珠状核小体。这是染色质的基本结构单位。核小体长链进一步卷曲，每6个核小体为1圈，H₁组蛋白在内侧相互接触，形成直径为30nm的螺旋筒(solenoid)结构，组成染色质纤维(图4-7)。在形成染色单体时，螺旋筒再进一步卷曲、折叠。人体每个细胞中长约1.7m的DNA双螺旋链，最终压缩了8400多倍，分布于各染色单体中；46个染色单体总长仅200μm左右，储于细胞核中。

在30nm的核小体纤维中，DNA获得上百倍的包装比，而且染色体DNA的某一些部分和“核骨架”(nuclearscaffold)相连接。这些骨架相连接的部分把染色体DNA分隔成许多长度不同的DNA环(20000至100000碱基对)，每个环(loops)有相对独立性。当一个环被打断或被核酸酶所松驰时，其他环仍可保持超螺旋状态。实验还证实真核染色体，还有更多层次的组织形式，每个层次都使染色体的包装变得更致密。因此真核染色体DNA包装是一个缠绕再接一次更高级的缠绕和包装，这种高层次包装的模式图如图4-8。染色质中还存在一些非组蛋白(nonhistone proteins)，一些非组蛋白参与了调节特殊基因的表达，以控制同种生物的基因组可以在不同组织与器官中表达出不同生物功能的活性蛋白。

(a)核小体结构模式  (b)核小体纤维模式图

图4-6  核小体是DNA与组蛋白的复合物

图4-8  真核染色体不同层次的结构包装模型

(六) 基因与基因组

基因位于染色体上，在一条染色体上有很多基因，代表特定性状的特定基因与某一条特定染色体上的特定位置相联系，因此基因是在染色体上占有一定空间的特定DNA片段。真核生物的体细胞里每条染色体都有其另一条同源染色体，即一个染色体是由二条染色单体配对存在的，所以体细胞是二倍体(diploid)细胞；而生殖细胞里每条染色体都只有一条，所以是单倍体(haploid)细胞。二倍体细胞每一个基因也是成对存在的，每一对基因分别位于来自双亲的染色体的同一位置上，此位置称基因座(locus)，一对同源染色体在同一基因座上的一对基因称为一对等位基因(allele)。每一个体的每一基因座上只有两个等位基因、可是在一个群体中，每个基因座上可以有两个以上等位基因，这就是复等位基因(multiple allele)。

当一个生物体带有一对完全相同的等位基因时，则该生物体就该基因而言是纯合的(homozygous)或可称纯种(true-breeding)；反之，如果一对等位基因不相同，则该生物体是杂合的(heterozygous)或可称杂种(hybrid)。

等位基因各自编码蛋白质产物决定某一性状，并可因突变而失去功能，等位基因之间存在相互作用，当一个等位基因决定生物性状的作用强于另一等位基因并使生物只表现出其自身的性状时，就出现显隐性关系，作用强的是显性，作用被掩盖而不能表现的为隐性，显性完全掩盖隐性的是完全显性(complete dominance)，两者相互作用而出现介于两者的中间性状的是不完全显性(incomplete dominance)。

操纵子模型的建立进一步丰富了基因概念。基因不仅是传递遗传信息的载体，同时又具有调控基他基因表达活性的功能。操纵子(operon)由操纵基因与它操纵的几个结构基因连锁在一起，几个结构基因由一个启动子转录成为一个mRNA，然后翻译成几种功能蛋白质。操纵基因还受调节基因产生的阻遏物进行调节，进而控制结构基因的功能。这些基因互相制约构成了一套基因功能调节控制系统，使生物在不同环境下表现出不同的遗传特性。可见基因是可分的，这不仅体现在基因结构上，而且在功能上也可分为编码产生某种蛋白质子的基因，以及负责调节其他基因功能的基因，基因不仅能单独起作用，而且在每个基因之间还有一个相互制约、反馈调节的网络，每个基因都在各自的系统中发挥各自的功能。所以基因可以有其自身的产物，基因也可以没有产物。这样，一个基因一种蛋白以及基因是决定合成某种蛋白质分子的功能单位的概念也就需要进一步拓展其内涵了。

生物体基因组由整套染色体组成，一条染色体就是一个双链DNA分子，DNA分子中的全部核苷酸序列分别构成了基因和各种结构单元。基因组的DNA分子，也可划分为基因的编码序列和非编码序列。分析解剖基因组内多种DNA序列的结构特征，有助于解读这些DNA序列中包含的遗传信息，认识其生物学功能，以其最终认识所有生物的遗传本性。基因组DNA序列按其结构和功能可分成以下几类：

1. 基因序列和非基因序列 基因序列指基因组决定蛋白质(或RNA产物)的DNA序列，一端为ATG起始密码子，另一端则是终止密码子。非基因序列则是基因组中除基因序列以外的所有DNA序列，主要是两个基因之间的间插序列。

2. 编码序列和非编码序列 编码序列指编码RNA和蛋白质的DNA序列。由于基因是由内含子和外显子组成，内含子是基因内的非蛋白编码序列。所以内含子序列以及居间序列统称为非蛋白质编码序列。

3. 单一序列和重复序列 单一序列是基因组里只出现一次的DNA序列。重复序列指在基因组里重复出现的DNA序列。基因组内的重复序列有的是分散分布，有的是成簇存在。根据DNA序列在基因组中的重复频率，可将其分为轻度重复序列，中度重复序列和高度重复序列。

基因组学(genomics)是研究生物体基因和基因组的结构组成，稳定性及功能的一门学科。它包括结构基因组学(structural genomics)和功能基因组学(functional genomics)。前者是研究基因和基因组的结构，各种遗传元件的序列特征，基因组作图和基因定位等；后者是研究不同的序列具有的不同功能，基因表达的调控，基因和环境之间(包括基因与基因，基因与其他DNA序列，基因与蛋白质)的相互作用等。

二、RNA的种类和分子结构

(一) RNA的类型

根据结构、功能不同，动物、植物和微生物细胞的RNA主要有三类：核蛋白体RNA(ribosomal RNA，rRNA)，转运RNA(transferRNA,tRNA)，信使RNA(messenger RNA,mRNA)。

1. 核蛋白体RNA 核蛋白体RNA是细胞中主要的一类RNA，rRNA占细胞中全部RNA的80%左右，是一类代谢稳定、分子量最大的RNA，存在于核蛋白体内。

核蛋白体(ribosome)又称为核糖体或核糖核蛋白体。它是细胞内蛋白质生物合成的场所。在迅速生长着的大肠杆菌中，核蛋白体约占细胞干物质的60%。每个细菌细胞约含16×10³个核蛋白体。每个真核细胞约有1×10⁶个核蛋白体。原核生物核蛋白体中蛋白质约占1/3，rRNA约占2/3；真核生物核蛋白体中蛋白质和rRNA各占一半。核蛋白体由两个亚基组成，一个称为大亚基，另一个称为小亚基，两个亚基都含有rRNA和蛋白质，但其种类和数量却不相同。

S为沉降系数单位。1个S单位=1×10^-13秒

大肠杆菌核蛋白体的沉降系数为70×10^-13秒，用S单位表示则为70S。

2. 转运RNA(转移RNA)  转运RNA是细胞中一类最小的RNA，tRNA一般由73～93个核苷酸构成，分子量23 000～28000。在已测定核苷酸序列的tRNA中，链最短的为63个核苷酸，如牛心线粒体丝氨酸tRNA，链最长的有93个核苷酸，如大肠杆菌丝氨酸tRNA。tRNA的沉降系数为4S。tRNA约占细胞中RNA总量的15%。在蛋白质生物合成中tRNA起携带氨基酸的作用。细胞内tRNA的种类很多，每一种氨基酸都有与其相对应的一种或几种tRNA。

3. 信号RNA mRNA在细胞中含量很少，占RNA总量的3%～5%。mRNA在代谢上很不稳定，它是合成蛋白质的模板，每种多肽链都由一种特定的mRNA负责编码。因此，细胞内mRNA的种类很多。mRNA的分子量极不均一，其沉降系数在4～25S间，mRNA的平均分子量约500000。大肠杆菌的mRNA平均含有900～1500个核苷酸。真核mRNA中最大的是丝心蛋白mRNA，它由19 000个核苷酸组成。

除上述三类RNA以外，细胞内还有一些其他类型的RNA，如细胞核内的不均一核RNA(HnRNA,heterogeneousnuclear RNA)、核小RNA(SnRNA, small nuclear RNA)和染色体RNA(ChRNA, chromosomal RNA)等。

近年的研究表明，一些长度较短的RNA，即所谓“小核糖核酸”(SnRNA)能够对细胞和基因的很多行为进行调控，比如打开或关闭多种基因，删除一些不需要的DNA片段等，SnRNA在核糖体生物合成中调控作用的确定，使rRNA加工中的许多难点获得突破。SnRNA在细胞分裂过程中也发挥重要调控作用，可指导染色体的物质形成正确的结构。这些发现有望为操作干细胞提供新工具以及用于研究治疗癌症等由于基因组错误所导致的疾病的新方法。

 (二) RNA的结构特征

(1) RNA的基本组成单位是AMP、GMP、CMP及UMP。一般含有较多种类的稀有碱基核苷酸，如假尿嘧啶核苷酸及带有甲基化碱基的多种核苷酸等。

(2) 每分子RNA中约含有几十个至数千个NMP，与DNA相似，彼此通过3",5"-磷酸二酯键连接而成多核苷酸链。

(3) RNA主要是单链结构，但局部区域可卷曲形成双链螺旋结构，或称发夹结构(hairpin structure)。双链部位的碱基一般也彼此形成氢键而互相配对，即A—U及G—C，双链区有些不参加配对的碱基往往被排斥在双链外，形成环状突起(图4-9)。

(4) RNA与DNA对碱的稳定性不同，RNA易被碱水解，使5"-磷酸酯键断开，形成3"-磷酸酯键的单核苷酸。DNA无2"-羟基，则不易被碱水解。

(三) 参与蛋白质生物合成的三类RNA的结构

细胞内RNA分子的主要生物功能是参与蛋白质的生物合成，主要有三大类，即核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)，转运RNA(transfer RNA,tRNA)及信使RNA(mssenger RNA,mRNA)。

1. tRNA的结构 每一种氨基酸都有2～6种相应的tRNA，分散于胞液中。书写各种不同氨基酸的tRNA时，在右上角注以氨基酸缩写符号，如tRNA^Phe代表转运苯丙氨酸的tRNA。

(1) 一级结构：tRNA皆由70～90个核苷酸组成，有较多的稀有碱基核苷酸，3"-末端为—C—C—AOH，沉降系数都在4S左右。

(2) 二级结构：根据碱基排列模式，呈三叶草式(clover leaf)。双链互补区构成三叶草的叶柄，突环(loop)好像三片小叶。大致分为氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TφC环等5部分(图4-10)。

图4-10  酵母tRNA^Ala的核苷酸序列

hU：二氢尿苷酸  Ⅰ：次黄苷酸  m¹G:1-甲基鸟苷酸  m¹Ⅰ:1-甲基次黄苷酸  m²₂G:N²-二甲基鸟苷酸φ：假尿苷酸

①氨基酸臂：由7对碱基组成，富含鸟嘌呤。末端为—CCA。蛋白质生物合成时，用于连接活化的相应氨基酸；②二氢尿嘧啶环(DhU loop)：由8～12个核苷酸组成，含有二氢尿嘧啶，故称为二氢尿嘧啶环；③反密码环：由7个核苷酸组成。环的中间是反密码子(anticodon)，由3个碱基组成，次黄嘌呤核苷酸常出现于反密码子中；④额外环(extra loop)：由3～18个核苷酸组成。不同的tRNA，此环大小不一，是tRNA分类的指标；⑤TφC环：由7个核苷酸组成。因环中含有T—φ—C碱基序列，故名。

(3)三级结构：酵母tRNA^Phe呈倒L形的三级结构。其他tRNA也类似。氨基酸臂与TφC臂形成一个连续的双螺旋区(图4-11)，构成字母L下面的一横，二氢尿嘧啶臂与反密码臂及反密码环共同构成L的一竖。二氢尿嘧啶环中的某些碱基与TφC环及额外环中的某些碱基之间可形成一些额外的碱基对，维持了tRNA的三级结构。大肠杆菌的起始tRNA^met、tRNA^Arg及酵母tRNA^Asp都与此类似，但L两臂夹角有些差别。

图4-11  tRNA^phe的三级结构

2. mRNA的结构 mRNA为传递DNA的遗传信息并指导蛋白质合成的一类RNA分子。mRNA占细胞内RNA总量的2%～5%，代谢活跃，更新迅速，半衰期一般较短。

(1)分子量大小不一，由几百至几千个核苷酸组成。

(2)极大多数真核细胞mRNA在3"末端有一段长约200个碱基的多聚腺苷酸(polyA)。

(3)真核mRNA的5"末端有一特殊结构：7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸，称为帽子结构，与蛋白质生物合成的起始有关，其结构如下：

7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸（M⁷G^5’PPP^5’NP)

(4)mRNA分子中有编码区和非编码区。编码区是所有mRNA分子的主要结构部分，该区域编码特定蛋白质分子的一级结构，非编码区与蛋白质合成的调控有关。

(5)每分子mRNA可与几个至几十个核糖体结合成串珠样的多核糖体(polysome)。

mRNA是在核蛋白体将记录在DNA分子中的遗传信息转化成蛋白质氨基酸顺序时的模板。mRNA的核苷酸排列顺序与基因DNA核苷酸顺序互补。每个细胞约在10⁴分子mRNA。mRNA是单链RNA，其长度变化很大。mRNA的长度取决于它所指导合成的蛋白质长度。例如，如果一个蛋白质含有100个氨基酸，那么编码合成这种蛋白质的mRNA至少需要300个核苷酸长度，因为三个核苷酸编码一个氨基酸。但是，实际上，mRNA的长度一般都比指导蛋白质合成所需要的核苷酸链长度为长。这是因为分子中有些区段是不参加翻译的区段。

原核细胞的mRNA具有下列结构特点：

(1)包括细胞和病毒的原核细胞mRNA一般都为多顺反子结构，即一个单链mRNA分子可作为多种多肽和蛋白肽链合成的模板。

(2)原核细胞mRNA的转录与翻译是耦合的，即mRNA分子一边进行转录，同时一边进行翻译。

(3)原核细胞mRNA分子包含有先导区、翻译区和非翻译区，即在二个顺反子之间有不参加翻译的插入顺序。

与原核细胞结构相比较，真核细胞mRNA的结构具有以下明显不同特点：

(1)极大多数真核细胞mRNA的3"末端有一段多聚腺苷酸(polyA⁺)，其长度约200个腺苷酸。原核细胞mRNA3"末端一般不含polyA⁺顺序。而polyA⁺的结构与mRNA从细胞核移至细胞质过程有关，也与mRNA的半衰期有关。新合成的mRNA polyA⁺较长，衰老mRNA的polyA⁺较短；另外，真核细胞mRNA的5"-末端有一个特殊结构—7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸(通常有三种类型m⁷G⁵PPP⁵NP,m⁷G⁵PPP⁵N"mPNP和m⁷G⁵PPP⁵N"mPNmP)这种结构简称帽子结构，原核生物mRNA无帽子结构。

(2)真核细胞mRNA一般为单顺反子(即一个mRNA分子只为一种多肽编码)。

(3)真核细胞mRNA的转录与翻译是分开进行的，先在核内转录产生前体mRNA(核不均一RNA，即HnRNA)，转运到胞浆内后，再在核外加工为成熟mRNA，然后起翻译作用。

3. rRNA结构 rRNA分子大小不均一。真核细胞的rRNA有4种，其沉降系数分别为58S，5.8S，5S和18S，大约与70种蛋白质结合而存在于细胞质的核蛋白体的大小两个亚基中。5sRNA与tRNA相似，具有类似三叶草型的二级结构。

其他RNA，如16SrRNA，23S rRNA及病毒RNA也是由部分双螺旋结构和部分突环相间排列组成的。由DNA转录的产物总是单链RNA，单链RNA趋向于右手螺旋构象，其构象基础是由碱基堆积而成的(图4-12)。由于嘌呤基之间的堆积力比嘌呤基与嘧啶基或嘧啶基与嘧啶基之间的堆积力强，因此嘧啶碱基常常被挤出而形成两个嘌呤碱基的相互作用。RNA能和具有互补顺序的RNA或DNA链进行碱基配对。

与双链DNA不同，RNA没有一个简单的有规律的二级结构。在有互补顺序的地方形成的双链螺旋结构主要是A型右手螺旋。由于错配或无配对碱基常常打断螺旋，而在RNA分子中间形成“突起”和“环”，在RNA链内最近的自身互补顺序能形成发卡环(图4-13)。RNA分子中形成的发卡结构是RNA具有的最普遍的二级结构形式。

有些短序列如uuGG序列，常常存在于RNA发卡结构的末端，形成结实稳定的环，在形成RNA分子的三维结构中起重要作用，氢键是RNA三维

结构的另一种维持作用力。在rRNA分子中存在大量氢键配对，分子中含有许多基环结构，尤其是大的rRNA分子，存在许多螺旋区和环区，每个区域在结构上和功能上都是相对独立的单位，因此尽管有些rRNA的一级结构序列不同，但它们的三维结构却十分类似(图4-14)。

(a)E.coli 16-s-rRNA (b)酵母16-S-rRNA

图4-14  大肠杆菌与酿酒酵母16-S-rRNAs的三维结构

(两种来源不同的16-S-rRNAs，虽然一级结构不同，但它们的三维结构却十分近似。)

第三节 核酸的理化性质

一、 核酸的分子大小

采用电子显微镜照相及放射自显影等技术，已能测定许多完整DNA的分子量。噬菌体T₂DNA的电镜像显示整个分子是一条连续的细线，直径为2nm，长度为(49±4)μm。由此计算其分子量约为1×10⁸。大肠杆菌染色体DNA的放射自显影像为一环状结构，其分子量约2×10⁹。真核细胞染色体中的DNA分子量更大。果蝇巨染色体只有一条线形DNA，长达4.0cm，分子量约为8×10¹⁰，为大肠杆菌DNA的40倍。RNA分子比DNA短得多，其分子量只达(2.3～110)×10⁴。

二、 核酸的溶解度与粘度

RNA和DNA都是极性化合物，都微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐比自由酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达4%。

高分子溶液比普通溶液粘度要大得多，不规则线团分子比球形分子的粘度大，而线性分子的粘度更大。由于天然DNA具有双螺旋结构，分子长度可达几厘米，而分子直径只有2nm，分子极为细长，因此，即使是极稀的DNA溶液，粘度也极大。RNA分子比DNA分子短得多，RNA呈无定形，不像DNA那样呈纤维状，RNA的粘度比DNA粘度小。当DNA溶液加热，或在其他因素作用下发生螺旋→线团转变时，粘度降低。所以可用粘度作为DNA变性的指标。

三、 核酸的酸碱性质

多核苷酸中两个单核苷酸残基之间的磷酸残基的解离具有较低的pK"值(pK"=1.5)，所以当溶液的pH高于4时，全部解离，呈多阴离子状态。因此，可以把核酸看成是多元酸，具有较强的酸性。核酸的等电点较低，酵母RNA(游离状态)的等电点为pH2.0～2.8。多阴离子状态的核酸可以与金属离子结合成盐。一价阳离子如Na⁺、K⁺，两价阳离子如Mg²⁺、Mn²⁺等都可与核酸形成盐。核酸盐的溶解度比游离酸的溶解度要大得多。多阴离子状态的核酸也能与碱性蛋白，如组蛋白等结合。病毒与细菌中的DNA常与精胺、亚精胺等多阳离子胺类结合，使DNA分子具有更大的稳定性与柔韧性。

由于碱基对之间氢键的性质与其解离状态有关，而碱基的解离状态又与pH有关，所以溶液中的pH直接影响核酸双螺旋结构中碱基对之间氢键的稳定性。对DNA来说碱基对在pH4.0～11.0之间最为稳定。超越此范围，DNA就要变性。

四、 核酸的紫外吸收

由于核酸的组成成分嘌呤及嘧啶碱具有强烈的紫外吸收，所以核酸也有强烈的紫外吸收。最大吸收值在260nm处(图4-12)。利用这一特性，可以鉴别核酸样品中的蛋白质杂质。

利用核酸的紫外吸收特性，还可对核酸进行定量测定。由于核酸制品的纯度不一，分子量大小不同，所以很难以核酸的重量来表示它的克分子消光系数。因核酸分子中碱基和磷原子的含量相等，因此可以根据磷的含量测定核酸溶液的吸收值。以每升的核酸溶液中1克原子磷为标准来计算核酸的消光系数，就叫克原子磷消光系数e(p)。

e(p)=

式中：A为吸收值，C为每升溶液中磷的克原子数，L为比色杯内径的厚度。由于：

C=

所以上式可改写成：

e(p)=

这样，只要测定核酸溶液的磷含量和紫外吸收值，就可以求得它的e(p)值。一般，DNA的e(p)值均较其所含核苷酸单体的e(p)值的总和要低20%～60%。降低程度与核酸分子中双链结构多少有关。核酸在变性时，e(p)值显著升高，此现象称为增色效应(hyperchromic effect)(图4-12)。在一定条件下，变性核酸可以复性，此时e(p)值又回复至原来水平，这一现象叫减色效应(hypochromic effect)。所以，e(p)值可作为核酸复性的指标。减色效应是由于在DNA双螺旋结构中堆积的碱基之间的电子相互作用，而减低了对紫外光的吸收。

五、 核酸的变性、复性和杂交

(一) 变性

核酸分子具有一定的空间结构，维持这种空间结构的作用力主要是氢键和碱基堆积力。有些理化因素会破坏氢键和碱基堆积力，使核酸分子的空间结构改变，从而引起核酸理化性质和生物学功能改变，这种现象称为核酸的变性。核酸变性时，其双螺旋结构解开，但并不涉及核苷酸间共价键的断裂，因此变性作用并不引起核酸分子量降低。多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂叫降解。伴随核酸的降解，核酸分子量降低。

多种因素可引起核酸变性，如加热、过高过低的pH、有机溶剂、酰胺和尿素等。加热引起DNA的变性称为热变性。将DNA的稀盐溶液加热到80～100℃几分钟，双螺旋结构即被破坏，氢键断裂，两条链彼此分开，形成无规则线团。这一变化称为螺旋→线团转变(图4-13)。随着DNA空间结构的改变，引起一系列性质变化，如粘度降低，某些颜色反应增强，尤其是260nm紫外吸收增加，DNA完全变性后，紫外吸收能力增加25%～40%。DNA变性后失去生物活性。DNA热变性的过程不是一种“渐变”，而是一种“跃变”过程，即变性作用不是随温度的升高徐徐发生，而是在一个很狭窄的临界温度范围内突然引起并很快完成，就像固体的结晶物质在其融点时突然融化一样。通常把e(p)值达到最高值的1/2时的温度称为“熔点”或熔解温度(melting temperature)，用符号T_m表示。DNA的T_m值一般在70～85℃之间(图4-14)。

DNA的T_m值与其分子中的G—C含量呈正比关系，G—C对含量越多，T_m值就越高，这是因为G—C对之间有三个氢键，所以含G—C对多的DNA分子更为稳定。而G—C对含量低，则T_m值低。因此测定T_m可推算DNA分子中G—C对含量，其经验公式为：

(G+C)%=(T_m-69.3)×2.44

T_m值还受介质中离子强度的影响，一般说，在离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，而离子强度较高时，DNA的T_m值也较高。所以DNA制品不应保存在极稀的电解质溶液中，一般在1mol/L氯化钠溶液中保存较为稳定。

图4-13  DNA的变性过程

RNA也具有螺旋→线团之间的转变。但由于RNA只有局部的双螺旋区，所以这种转变不如DNA那样明显。变性曲线不那么陡，T_m值较低。tRNA具有较多的双螺旋区，所以具有较高的T_m值，变性曲线也较陡。RNA变性后紫外吸收值约增加1.1%。

(二) 复性

变性DNA在适当条件下，可使两条彼此分开的链重新由氢键连接而形成双螺旋结构，这一过程叫复性(renaturation)。复性后DNA的一系列物理化学性质得到恢复，如e(p)值降低，粘度增高，生物活性部分恢复。通常以e(p)值的改变作为复性的指标。将热变性DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性，而在缓慢冷却时才可以复性。

(三) 核酸的杂交

将不同来源的DNA经热变性，冷却，使其复性，在复性时，如这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则会形成杂交DNA分子。DNA与互补的RNA之间也会发生杂交。核酸杂交(hybridization)可以在液相或固相载体上进行。

最常用的是以硝酸纤维素膜作为载体进行杂交。英国分子生物学家E.M.Southern创立的Southerm印迹法(Southernblotting)就是将凝胶电泳分离的DNA片段转移至硝酸纤维素膜上后，再进行杂交。其操作是将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，将胶浸泡在NaOH中进行DNA变性，然后将变性DNA片段转移到硝酸纤维素膜上在80℃烤4～6小时，使DNA固定在膜上，再与标记的变性DNA探针进行杂交，杂交反应在较高盐浓度和适当温度(68℃)下进行10多小时，经洗涤除去未杂交的标记探针、将纤维素膜烘干后进行放射自显影即可鉴定待分析的DNA片段。除DNA外，RNA也可用作探针(probe)。可用³²P标记探针、也可用生物素标记探针。

将RNA经电泳变性后转移至纤维素膜上再进行杂交的方法称Northern印迹法(Northernblotting)。根据抗体与抗原可以结合的原理，用类似方法也可以分析蛋白质，这种方法称Western印迹法(Western blotting)。应用核酸杂交技术，可以分析含量极少的目的基因，是研究核酸结构与功能的一个极其有用的工具。

第四节 核酸的分离与含量测定

一、 核酸的提取、分离和纯化

提取核酸的一般原则是先破碎细胞，提取核蛋白使其与其他细胞成分分离。然后用蛋白质变性剂如苯酚或去垢剂(十二烷基硫酸钠)等，或用蛋白酶处理除去蛋白质。是后所获得的核酸溶液用乙醇等使其沉淀。

在提取、分离、纯化过程中应特别注意防止核酸的降解。为获得天然状态的核酸，在提取过程中，应防止核酸酶、化学因素和物理因素所引起的降解。

为了防止内源性核酸酶对核酸的降解，在提取和分离核酸时，应尽量降低核酸酶的活性。通常加入核酸酶的抑制剂。在核酸的提取过程中常用酸碱，所以在提取时应注意强酸强碱对核酸的化学降解作用。核酸(特别是DNA)是大分子，高温、机械作用力等物理因素均可破坏核酸分子的完整性。因此核酸的提取过程应在低温(0℃左右)以及避免剧烈搅拌等条件下进行。

(一) DNA的分离纯化

真核细胞中DNA以核蛋白形式存在。DNA蛋白(DNP)在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度显著不同。DNP溶于水，在0.14mol/L氯化钠溶液中溶解度最小，仅为水中溶解度的1/100。当氯化钠浓度再增加时，其溶解度又增加，例如在0.5mol/L时溶解度与水相似，而当氯化钠增至1mol/L时，DNP溶解度较在水中大两倍以上。利用这一性质可将DNP从破碎后的细胞匀浆中分离出来，也可以使DNA蛋白和RNA蛋白分离，因为DNA蛋白不溶于0.14mol/L氯化钠溶液，而RNA蛋白溶于0.14mol/L氯化钠溶液。DNA蛋白的蛋白部分可用下列方法除去：

用苯酚提取：水饱和的新蒸馏苯酚与DNP振荡后，冷冻离心。DNA溶于上层水相中，中间残留物也杂有部分DNA，变性蛋白质在酚层内。这种操作需要反复多次。将含DNA的水相合并后，加入相当于2.5倍体积的冷水无水乙醇，可将DNA沉淀出来。此时DNA呈十分粘稠的物质，可用玻璃棒绕成一团，www.med126.com/rencai/取出。由于苯酚能使蛋白质迅速变性，当然也抑制了核酸酶的降解作用。整个操作条件比较缓和，可用此法得到天然状态的DNA。

用三氯甲烷-戊醇提取：将DNP溶液和等体积的三氯甲烷-戊醇(3∶1)剧烈振荡，离心，上层水液含DNA、蛋白质，下层为三氯甲烷和戊醇，两层之间为蛋白质凝胶。上层水相再用三氯甲烷-戊醇的混合液处理，并反复数次，至两层之间无蛋白质胶状物为止。

去污剂法：用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂可使蛋白质变性。用这种方法可以获得一种很少降解，而又可以复制的DNA制品。

酶法：用广谱蛋白酶使蛋白质水解。DNA制品中有少量RNA杂质，可用核糖核酸酶除去。

柠檬酸钠有抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)的作用。制备DNA时，常用它来防止DNase引起的降解。由于DNase作用时需要Mg²⁺，而柠檬酸钠作为一种螯合剂，可以除去Mg²⁺，所以有抑制DNase的作用。

天然的DNA分子有的呈线性，有的呈环形。采用下列方法可以将不同构象的DNA分离。

蔗糖梯度区带超离心，可按DNA分子的大小和形状进行分离。

氯化铯密度梯度平衡超离心，可按DNA的浮力密度不同进行分离。双链DNA中如插入溴化乙锭等染料后，可以减低其浮力密度。但由于超螺旋状态的环状DNA中插入溴化乙锭的量比线状或开环DNA分子少，所以前者的浮力密度降低较小。因此，可将这几类DNA进行分离。

羟甲基磷灰石和甲基白蛋白硅藻土柱层析也是常用的纯化DNA的方法。

RNA和DNA杂交已广泛地应用于基因分离。在应用分子杂交纯化基因的工作中最初是用硝酸纤维素方法。硝酸纤维素可以吸附变性DNA，但天然DNA和RNA不被吸附。RNA-DNA杂交体仍有游离的变性DNA区，所以也能被吸附。洗脱不吸附的DNA、RNA等杂质，再分别将变性DNA和杂交RNA-DNA洗脱下来，如此则可得到纯化的DNA。

(二) RNA的分离纯化

细胞内主要的RNA有三类：mRNA、rRNA和tRNA。目前在实验室先将细胞匀浆进行差速离心，制得细胞核、核蛋白体和线粒体等细胞器和细胞质。然后再从这些细胞器分离某一类RNA。从核蛋白体分离rRNA，从多聚核蛋白体分离mRNA，从线粒体分离线粒体DNA和RNA。从细胞核可以分离核内RNA，从细胞质可以分离各种tRNA。

RNA在细胞内也常和蛋白质结合，所以必须除去蛋白质。从RNA提取液中除去蛋白质的方法有以下几种：

(1) 在10%氯化钠溶液中加热至90℃，离心除去不溶物，加乙醇使RNA沉淀，或者调节pH至等电点使RNA沉淀。

(2) 用盐酸胍(最终浓度2mol/L)可溶解大部分蛋白质，冷却，RNA即沉淀析出。粗制品再用三氯甲烷除去少量残余蛋白质。

(3) 去污剂法，常用的为十二烷基硫酸钠(SDS)，使蛋白质变性。

(4) 苯酚法，可用90%苯酚提取，离心后，蛋白质和DNA留在酚层，而RNA在上层水相内，然后进一步分离。

制备RNA时常用的RNA酶抑制剂如皂土，皂土有吸附RNA酶的能力。

RNA制品中往往混有链长不等的多核苷酸。这些多核苷酸或者是不同类型的RNA，或者是RNA的降解产物。可以采用下列方法加以进一步纯化，得到均一的RNA制品：

蔗糖梯度区带超离心，可将18S、28S、4S RNA分开。

聚丙烯酰胺凝胶电泳，可将不同类型的RNA分开。

甲基白蛋白硅藻土柱、羟基磷灰石柱、各种纤维素柱，都常用来分级分离各种类型的RNA。寡聚dT-纤维素柱用于分离mRNA，效果很好。凝胶过滤法也是分离RNA的有用方法。分离mRNA还可用亲和层析法和免疫法。

二、 核酸含量测定的原理

(一) 定磷法

RNA和DNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9.4%，DNA的平均含磷量为9.9%。因此，可从样品中测得的含磷量来计算RNA或DNA的含量。

用强酸(如10mol/L硫酸)将核酸样品消化，使核酸分子中的有机磷转变为无机磷，无机磷与钼酸反应生成磷钼酸，磷钼酸在还原剂(如抗坏血酸、α-1，2，4-氢基萘酚磺酸、氯化亚锡等)作用下还原成钼蓝。可用比色法测定RNA样品中的含磷量。

(二) 定糖法

RNA含有核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对RNA和DNA进行定量测定。

1. 核糖的测定 RNA分子中的核糖和浓盐酸或浓硫酸作用脱水生成糠醛。糠醛与某些酚类化合物缩合而生成有色化合物。如糠醛与地衣酚(3，5-二羟甲苯)反应产生深绿色化合物，当有高铁离子存在时，则反应更灵敏。

反应产物在660nm有最大吸收。并且与RNA的浓度成正比。

2. 脱氧核糖的测定 DNA分子中的脱氧核糖和浓硫酸作用，脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺反应生成蓝色化合物。

反应产物在595nm处有最大吸收，并且与DNA浓度成正比。

(三) 紫外吸收法

利用核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性。用这种方法测定核酸含量时，通常规定在260nm，测得样品DNA或RNA溶液的A₂₆₀值，即可计算出样品中核酸的含量。

(吴梧桐)