第四章 紫外-可见分光光度法
第一节 概 述
紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry, UVS)是光学分析法中一种重要而应用广泛的分析方法。光学分析法(optical analysis)是建立在电磁辐射与物质相互作用基础上，以电磁辐射为“探针”来探测物质性质、结构及含量的一种分析方法。根据不同的分类依据主要可分为以下几类：
1.光谱法和非光谱法 光谱法(spectroscopy)又称为光谱分析法（spectroscopicanalysis)，是指当物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁，根据能级跃迁时产生的辐射能强度随波长的变化建立的分析方法。光谱法又分为吸收光谱法，发射光谱法和散射光谱法等基本类型。
非光谱法是指当物质与辐射能相互作用时，不涉及物质内部能级的跃迁，即不以光的波长为特征信号，根据电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质的变化建立的分析方法。这类方法主要有折射法，旋光法，浊度法，X-射线衍射法等。
2.原子光谱法和分子光谱法 原子光谱法（atomic spectroscopy)是根据原子核外的电子在不同的电子能级间跃迁产生的原子光谱所建立的分析方法。这类方法主要包括原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法以及X-射线荧光光谱法等。
分子光谱法（molecularspectroscopy)是根据分子中电子能级、振动能级和转动能级的变化产生的分子光谱所建立的分析方法。主要有红外吸收光谱法、紫外－可见吸收光谱法、分子荧光光谱法、分子磷光光谱法等。
3. 吸收光谱法和发射光谱法 吸收光谱法(absorptionspectroscopy)是根据物质的分子或原子吸收与其能级跃迁相应的能量后由基态或低能态跃迁至高能态产生的吸收光谱所建立的分析方法。这类方法有分子吸收光谱法、原子吸收光谱法、核磁共振波谱法。
发射光谱法(emissionspectroscopy)是根据物质的分子或原子吸收与其能级跃迁相应的能量后由基态或低能态跃迁至高能态，再返回到基态或低能态产生的发射光谱所建立的分析方法。主要有原子发射光谱法、原子荧光光谱法、X-射线荧光光谱法、分子荧光光谱法、分子磷光光谱法等。
本章介绍的紫外-可见分光光度法是根据物质分子对紫外-可见光谱区光辐射的吸收特征和吸收程度，对物质进行定性和定量分析的一种吸收光谱法。在可见光区（波长400～760nm)测定称为可见分光光度法，在紫外光区（波长200～400nm)测定称为紫外分光光度法。紫外-可见分光光度法测定的灵敏度和准确度高，仪器结构较为简单，操作方便，快速可靠，易于掌握和推广，因而它是预防医学、卫生检验、医学检验、临床医学、药物分析、食品分析、环境保护等部门广泛采用的一种仪器分析方法。
为了更好地理解各种光学分析法，下面将对电磁辐射及其与物质的相互作用作简要介绍。
第二节 电磁辐射及其与物质的相互作用
一、电磁辐射与电磁波谱
光是一种电磁辐射(electromagnetic radiation)，又称电磁波，是一种以巨大速度通过空间传播的光量子流。它的基本单位是光子，光子具有微观粒子的波动性和粒子性，即波粒二象性。
光子的能量与频率或波长的关系：
（4-1)
式中，E 为光子的能量，单位为焦耳（J)或电子伏特（eV)；h 为Plank常数，数值为6.626×10-34焦耳秒（J·s)；ν为频率（赫兹,Hz)；c为光速，在真空中其值为2.998×1010厘米/秒（cm/s)；
式4-1中，h和c均为常数，因此，光子的能量与频率成正比，与波长成反比。
电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱（electromagnetic spectrum)。电磁波谱包括的波长范围很宽，表4-1列出了波长0.005nm～1000m的波谱区域。
表4-1 电磁波谱
| 辐射类型 | 波长范围 | 光谱类型 | 跃迁类型 |
| γ射线 | 0.005～0.14nm | γ射线光谱 | 核能级 |
| X射线 | 0.01～10nm | X射线光谱 | 内层电子能级 |
| 远紫外光 近紫外光 可见光 近红外光 中红外光 远红外光 微波 无线电波 | 10～200nm 200～400nm 400～760nm 0.76～2.5μm 2.5～50μm 50～1000μm 0.1～100cm 1～1000m | 真空紫外光谱 紫外光谱 可见光谱 红外光谱 红外光谱 红外光谱 微波波谱 核磁共振波谱 | 内层电子能级 原子及分子的价电子或成键电子能级 原子及分子的价电子或成键电子能级 分子振动能级 分子振动能级和转动能级 分子转动能级 分子转动能级和电子自旋能级 磁场诱导核自旋能级 |
二、电磁辐射与物质的相互作用
电磁辐射与物质的相互作用是普遍发生的比较复杂的物理现象，有涉及物质内能变化的吸收、荧光与磷光发射和拉曼散射等，以及不涉及物质内能变化的透射、折射、非拉曼散射、衍射和旋光等。
当辐射通过固体、液体或气体等透明介质时，电磁辐射的交变电场导致分子（或原子)的外层电子相对其核的振荡，致使这些分子（或原子)周期性的极化。若入射的电磁辐射能量正好与介质分子（或原子)基态与激发态之间的能量差相等，介质分子（或原子)就会选择性吸收这部分辐射能，从基态跃迁至激发态，然后以热或光等形式释放出能量，回到基态。以光的形式释放出能量的过程称为发射。
若入射的电磁辐射能量与介质分子（或原子)基态与激发态之间的能量差不相等，则电磁辐射不被吸收，分子（或原子)极化所需的能量仅被介质分子（或原子)瞬间（10-14～10-15s)保留，然后被再发射，从而产生光的透射、非拉曼光谱、反射、折射等物理现象。光从介质A照射到介质B的界面时，一部分光在界面上改变方向返回到介质A，称为光的反射；另一部分光则改变方向，以一定的折射角度进入介质B，此现象称为光的折射。在一定条件下光波会发生相互作用，当其叠加时，将产生一个强度视各波的相位而定的加强或者减弱的合成波，称为干涉。当两个波长的相位差180º时，则发生相消干涉；若两个波的相位相同时，则发生最大相长干涉。当光波通过狭缝或绕过障碍物时，将以约180º的角度向外辐射，波前进的方向则发生弯曲，此现象称为衍射。光的散射是指光子与介质分子之间发生弹性碰撞，在碰撞时没有能量交换，光的频率不变，但光子的运动方向则发生改变。而拉曼散射是由光子与介质分子之间发生了非弹性碰撞所致，碰撞时光子不仅改变了运动方向，而且还有能量交换，光的频率也发生了变化。
第三节 分子吸收光谱
一、分子吸收光谱的产生
当辐射通过气态、液态或固态物质时，物质的分子对辐射进行选择性的吸收，从而产生分子吸收光谱。
物质分子内部有三种运动状态：电子绕原子核作相对运动、分子内原子在其平衡位置上振动、分子作为整体绕轴转动。三种运动状态对应于三种能级，分别称为电子能级、振动能级和转动能级。每一个电子能级中有若干个振动能级,用V =0,1,2,3…表示;每一个振动能级中有若干个转动能级,用J =0,1,2,3…表示。双原子分子的三种能级跃迁示意图如图4-1所示。
图4-1 双原子分子的三种能级及其跃迁示意图
光的吸收是物质与辐射相互作用的一种形式，物质分子只能吸收能量等于其两个能级差△E的光子，分子吸收光能之后,受激发将从原来能量最低的能级(基态能级)跃迁到能量较高的能级(激发态能级)。
（4-2)
式中E1为分子基态的能量；E2为分子激发态的能量。由于光子的能量决定于频率,是量子化的,所以分子只能选择吸收能量与其能级间隔相一致的光子。
分子转动能级间的能量差最小,为0.005～0.05eV(对应光子的波长250～25mm),相当于远红外的能量。因此,分子发生转动能级跃迁时所产生的吸收光谱称为转动光谱或远红外光谱。
分子振动能级间的能量差约为0.05～1eV(相应波长25～1.25mm)。因此振动能级跃迁所产生的吸收光谱称为振动光谱或红外光谱。由于发生振动能级跃迁时同时伴有转动能级的跃迁，故振动光谱实质上是振动-转动光谱。
分子中电子能级间的能量差约为1～20eV(相应波长1.25～0.06mm)。因此由电子能级跃迁而产生的吸收光谱称为电子光谱或紫外-可见吸收光谱。在分子发生电子能级跃迁时同时伴随着振动能级和转动能级的跃迁,所以电子光谱实www.med126.com/wsj/际上是电子－振动－转动光谱。这种光谱是由一系列谱线连成的谱带,称为带状光谱,它比原子的线状光谱复杂得多。
由于各种物质分子的内部结构不同，且发生能级跃迁时吸收光能具有量子化的特征, 故物质对光的吸收具有选择性。
二、分子吸收光谱及其特征
测定某一溶液对不同波长单色光的吸光度（吸光度的定义见本章第四节)，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘图,所描绘的图形称为吸收光谱(absorption spectrum)，又称为吸收曲线(absorption curve)，如图4－2所示。吸光度最大处所对应的波长称为最大吸收波长（maximum absorption wavelength ,
图4-2 吸收曲线示意图
三、紫外-可见吸收光谱的主要类型
（一)有机化合物的电子跃迁和吸收带类型
许多有机化合物吸收紫外－可见光辐射后发生电子能级跃迁，产生吸收带。当有机化合物吸收了紫外或可见光以后，分子中单键的s电子、双键中的p电子和O、N、X或S等杂原子上未成键的孤对电子即n电子都有可能跃迁到各自能级较高的s*或p*反键轨道上去，图4-3为分子中价电子能级及跃迁示意图。
图4-3 分子中价电子能级及跃迁示意图
有机化合物分子中电子跃迁通常有四种类型，各种跃迁所需能量的大小顺序为：
s®s*>n®s*>p®p*>n®p*
1.s®s*跃迁 即分子中的电子从s轨道跃迁到s*轨道上的跃迁。实现s®s*跃迁所需的能量最大，所吸收的辐射波长一般小于150nm, 位于远紫外区。一般不讨论由s®s*跃迁所引起的吸收谱带。
2.n®s*跃迁 即电子从n轨道跃迁到s*轨道上的跃迁。含有非成键n电子的杂原子（如-OH、-NH2、-X等基团)的饱和烃衍生物，都会发生这种跃迁。实现n®s*跃迁所需的能量比s®s*跃迁的小，最大吸收波长一般在稍低于200nm的区域内,在紫外区仍不易观察到这类跃迁。
3.p®p*跃迁 即电子从p轨道跃迁到p*轨道上。这种跃迁所需的能量比n®s*的稍小些，孤立的p®p*跃迁的最大吸收波长一般也在200nm附近。p®p*跃迁的能量随着p-p共轭程度的增大而减少，如丁二烯分子p®p*跃迁所需的能量比乙烯分子p®p*跃迁所需的能量少。共轭双键中p®p*跃迁所产生的吸收带称为K带，其主要特点是摩尔吸光系数值一般大于104，为强带。如丁二烯的λmax为217nm, 摩尔吸光系数值为2.1×104，属于K带。
4.n®p*跃迁 即电子从n轨道跃迁到p*轨道上。实现n®π*跃迁所需的能量最小，因此，其最大吸收波长一般在近紫外区。含有杂原子的重键化合物（含
＞C=O，－C≡N等)都会发生这类跃迁。由n®p*跃迁引起的吸收带称为R带，它的主要特点是吸收弱，其摩尔吸光系数值一般在100以内。
在四类跃迁中，p®p*、n®p*跃迁所需能量在紫外或可见光区，吸收的波长可用紫外及可见分光光度计测定。p®p*跃迁与n®p*跃迁有两个重要差别：第一，摩尔吸光系数不同。p®p*跃迁的摩尔吸光系数很大，单个不饱和键的摩尔吸光系数在104左右；而n®p*跃迁的摩尔吸光系数很小，一般在10～100范围内。第二，溶剂的极性对这两种跃迁吸收峰波长影响不同。当溶剂的极性增加时，p®p*跃迁所产生的吸收峰（K带)向长波长移动，称长移（红移)；而n®p*跃迁所产生的吸收峰（R带)随溶剂的极性增加则向短波长移动，称短移（蓝移或紫移)。因为在p®p*跃迁的情况下，激发态的极性比基态的强，极性溶剂使激发态p*的能量比p的能量降低的多，p®p*跃迁就容易，因而使吸收峰红移。而在n®p*跃迁中，非成键n电子在基态时与极性溶剂容易形成稳定的氢键，引起n轨道能量降低，使跃迁时需能量多则变得不易发生，从而使吸收峰蓝移。另外，当R带受到附近的强吸收峰影响时，R带有时发生红移，有时则被掩盖。这种溶剂效应提示，在有机化合物的紫外吸收光谱测定中，应根据具体情况选择适当的溶剂。常用的溶剂有己烷、庚烷、环己烷、乙醇和水等。
（二)无机化合物中主要的电子跃迁及吸收带类型
1.配位场跃迁 指在配体的配位场作用下，镧系和锕系元素能量相等的f轨道或过渡金属元素能量相等的d轨道分裂成能量不等的f轨道或d轨道，在光能激发下低能态f电子或d电子跃迁到高能态的f轨道或d轨道上的跃迁，产生配位场吸收带。此类跃迁吸收峰波长受配位体的影响比较大，摩尔吸光系数一般小于102。
2．电荷迁移跃迁 指金属配合物中电子从配位体（电子给予体)的轨道跃迁到中心离子（电子接受体)的轨道上的跃迁，产生电荷迁移吸收带。此类跃迁的摩尔吸光系数一般大于104，测定灵敏度高，常常利用电荷迁移跃迁产生的吸收测定金属离子的含量。
四、有机化合物的紫外吸收光谱
1.饱和碳氢化合物 饱和碳氢化合物只有σ电子,只能发生σ®σ*跃迁,吸收峰在远紫外区，在紫外吸收光谱分析中常用作溶剂。
2.含孤立生色团或助色团的饱和化合物 生色团是指有机化合物分子结构中含有π®π*或n®π*跃迁、能在紫外可见光区产生吸收的原子团，如＞C=C＜、＞C=0、-N=N-、-NO2、＞C=S等。助色团是指能使饱和碳氢化合物或生色团的吸收峰蓝移、吸收程度增加的含有非键n电子的杂原子饱和基团，如-OH、-NH2、-OR、-SH、-Cl、-Br、-I等。
饱和碳氢化合物的氢被生色团或助色团取代后，分子内会产生n®σ*、n®π*、π®π*跃迁，吸收峰一般移至近紫外区。
3.共轭烯烃 分子中有共轭双键时,π®π*能级间隔变小,吸收峰长移,吸收增强。共轭体系越大,π®π*跃迁能量越小,红移越明显,摩尔吸光系数越大。
4.α、β不饱和醛、酮 α、β不饱和醛、酮分子中，羰基与C=C双键共轭，π®π*跃迁时吸收峰在200～260nm，n®π*跃迁时吸收峰在310～350nm。
5.芳香族化合物 芳香族化合物中最简单的是苯，苯具有环状共轭体系，发生π®π*跃迁。苯环上引入助色团或生色团时，则发生π®π*和n®π*跃迁，有多个吸收峰，吸收峰发生红移。苯环上取代基增多时，共轭体系增大，吸收峰红移更加明显。
利用有机化合物的紫外吸收光谱特征可初步推断有机化合物的分子骨架、官能团及共轭体系中取代基的种类、数目、位置等，在有机化合物的结构研究方面有一定的作用。
第四节 光的吸收定律
一、光的吸收定律
当一束平行的单色光通过吸收池中的溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液，还有一部分被吸收池表面反射。设入射光强度为
（4-3)
在分光光度法测定时，先用空白溶液调零,再测定样品溶液,吸收池的质量和厚度都相同,因而
（4-4)
透过光强度与入射光强度之比，称为透光度（transmittance)或透光率，用
透光度也常用
朗伯（Lambert)研究发现，在浓度c一定的条件下，溶液对单色光的吸收程度（吸光度)与液层的厚度b成正比，即朗伯定律，数学表达式为
(4-6)
式中
比尔(Beer)研究发现，在厚度b一定的条件下，溶液对单色光的吸收程度与其浓度c成正比，即比尔定律，数学表达式为
(4-7)
若同时考虑溶液的厚度b和浓度c，即把朗伯定律与比尔定律合并，得到朗伯-比尔定律（Lambert-Beer’slaw)，结合式4-5，则有
(4-8)
朗伯-比尔定律可表述为：当一束平行的单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。它是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依据。
式4-8中，
当浓度
（4-9)
摩尔吸光系数ε与吸光物质的性质、入射光波长、溶剂等因素有关。①物质性质不同，ε值大小不同；②溶剂不同，同种物质的ε值不同，使用时需指明溶剂；③入射光波长不同，ε值不同，应用时需指明波长。
在定量分析中则用ε值评价方法的灵敏度，ε值愈大，表示测定的灵敏度愈高。因此，在分析工作中，常通过选择实验条件以使吸光物质的ε值尽可能的大，以获得尽可能高的测定灵敏度。某一物质的ε值，则是通过测定适当低浓度溶液的吸光度后，代入式（4-9)计算得到。
当浓度
(4-10)
根据a与 的定义及物质的量浓度和质量浓度之间的关系可推导得：
式中,M为吸光物质的摩尔质量，单位为g/mol。
二、影响光吸收定律的因素
对于均匀体系，当溶液的厚度一定时，溶液的吸光度与吸光物质的浓度成正比，以吸光度A为纵坐标，标准溶液的浓度c为横坐标作图，得到的直线称为标准曲线（standard curve)。但实验发现，溶液浓度只有在适当低的范围时，A与c才成良好的线性关系。当溶液浓度较高时，标准曲线则发生弯曲，即偏离光吸收定律，如图4-4所示。
图4-4 吸光度与浓度的关系
影响光吸收定律的因素有多种，可归纳为两大类，即测定的试样因素和仪器因素:
1.与仪器有关的因素 仪器（分光光度计)的性能会影响光源的稳定性、入射光的单色性等。
（1)非单色光的影响 光吸收定律只有在入射光为单色光的情况下才能成立。但分光光度计的光源经单色器分光时，由于单色器分辨率的限制及仪器的狭缝必须保持一定的宽度才能得到足够的光强度，因此，由单色器获得的光并不是严格的单色光，而是包含一定波长范围的有限宽度的谱带，是以l0（中心吸收波长) 为中心的一狭窄波长范围的复合光。对于带宽为△的单色光，测得的吸光度一般小于l0处的真实吸光度值，产生负偏离。
（2)杂散光的影响 杂散光是指与所需波长相隔较远而不在谱带宽度范围内的光。杂散光的产生一般是由仪器元件的瑕疵或受尘埃污染及霉蚀所引起。若待测溶液吸收杂散光，产生正偏离；若待测溶液不吸收杂散光，则产生负偏离。
2.与试样溶液有关的因素
（1)溶液浓度的影响 当溶液处于高浓度时，吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子或离子之间的电荷分布互相影响，从而改变了它们对光的吸收能力，使吸光度与浓度之间的线性关系发生改变。
（2)体系（介质)不均匀的影响 当待测溶液为胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除了一部分光被待测物质吸收之外，还会有少部分光因折射、散射或反射而改变方向被损失掉，从而使透过光的强度减弱，实测的吸光度增加；当悬浊液发生沉淀时，又会使透过光强度增加，吸光度减少。这些情况都会导致偏离吸收定律。
（3)化学因素的影响 光吸收定律推导的基本假设之一，是试液中各组分没有相互作用。在吸光度测定中，溶液中的化学反应，如吸光物质发生离解、缔合、互变异构、配位或配合物组成变化等，都可改变其浓度，从而导致偏离光吸收定律。例如亚甲蓝阳离子单体的吸收峰为660nm，二聚体的吸收峰为610nm，随着浓度的增加，二聚体的吸收峰增强，单体的吸收峰则减弱。显然，亚甲蓝阳离子浓度不同，离解为单体与缔合为二聚体的情况不同，吸光度与浓度则不成线性关系。
第五节 分光光度计
一、分光光度计的主要部件
紫外-可见分光光度计(ultraviolet-visiblespectrophotometer)的基本组成可分为光源、单色器、吸收池、检测器、显示系统等五个部分，基本结构如方框图所示：
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1.光源(light source) 光源是提供入射光的装置。理想的光源应在广泛的光谱区域内发射连续光谱，具有足够的强度和良好的稳定性；在整个光谱区域内光的强度不随波长的变化而有明显的变化。但是，实际上几乎所有的光源其光强度都随波长的改变而改变。为了使投射到吸收池上光的强度在各个波长时都能保持一致，通常在分光光度计内装有光强度补偿装置。
分光光度计常用的光源有两类：即白炽光源（热光源)如钨丝灯及碘钨灯；以及气体放电光源如氢弧灯（简称氢灯)和重氢灯（即氘灯)。
钨灯或碘钨灯能发射出350～2500nm波长范围的连续光谱，最适宜的使用范围是360～1000nm，所以它是可见分光光度计的光源。电源电压对发光强度影响很大，为了保持光源发光稳定，通常采用稳压装置来稳定电源电压。
氢灯或氘灯能发射出150～400nm波长范围的连续光谱，是紫外分光光度计的光源。在相同操作条件下，重氢灯的光强度比氢灯约大四倍。由于玻璃能吸收紫外线，所以氢灯灯泡及窗口用石英材料制成。为使输出的光强稳定，也要有稳压装置。
2.单色器(monochromator) 单色器是将来自光源的光按波长的顺序分散为单色光并能随意调节波长的一种装置，是分光光度计的核心部件。单色器的主要组成部分是：
(1)入口狭缝 其作用是限制杂散光进入。
(2)出口狭缝 其作用是让色散后所需波长的光通过。
(3)色散元件 其作用是把混合光分散为单色光，是单色器的关键部分。常用的色散元件有三角棱镜和光栅。
1)棱镜 棱镜由玻璃或石英材料制成。对一般的棱镜材料，折射率（
式中
2)光栅 光栅有多种，光谱仪器中多采用平面反射光栅。它由高度抛光的表面上刻划的许多根平行线槽所组成。有600条/mm、1200条/mm、2800条/mm等。当复合光照射到光栅上面，光栅的每条刻线都产生衍射作用，而每条刻线所衍射的光又会相互干涉产生干涉条纹。不同波长的入射光产生的干涉条纹的衍射角不同，波长长的衍射角大，波长短的衍射角小，从而使复合光色散成按波长顺序排列的单色光。光栅色散性能比棱镜优越，光栅的色散基本是线性的，即在不同的波段范围，波长差相等的光被分开的距离基本相同，而棱镜的色散是非线性的。
(4)准直镜 它的作用是将来自入口狭缝的发散光变成平行光，并把来自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝。
3.吸收池(absorption cell) 用以盛装被测溶液。常用的吸收池是用无色、耐腐蚀的玻璃或石英材料制成，其中两面透明，两面为毛玻璃。前者用于可见光区，后者用于紫外光区。在定量分析中，所用吸收池须经过挑选。挑选方法一般是将同一厚度的一组吸收池装同一种空白溶液，于所选用波长下测定其透光度，透光度之差应小于0.5%。
4.检测器(detector) 它的作用是检测通过溶液后的光信号强度，并把光信号转变成电信号。检测器有光电管、光电倍增管、阵列型光电检测器。
(1)光电管 管内装有一个阳极和一个阴极，如图4-5所示。阳极为金属电极，通常用镍制成；阴极是一个金属半圆筒，其凹面涂有一层对光敏感的碱金属或碱金属氧化物或二者的混合物。管内抽真空或抽真空后充入少量惰性气体。当光照射到光敏阴极时，阴极发射出电子，电子受到具有高正电位的阳极吸引，产生电流。光愈强，发射的电子愈多，电流就愈大。产生的电流通过负载电阻
图4-5 光电管线路示意图
(2)光电倍增管 光电倍增管内装有一个涂有光敏金属的阴极和一个具有高正电位的阳极，另外管内还设有几个倍增光敏阴极，即二次发射极（又称打拿极)，一般设有9个倍增极。图4-6为光电倍增管及电路示意图。
图4-6 光电倍增管及电路示意图
当光照射到阴极上时，阴极即发射光电子。这些光电子在电场加速下，轰击到第一倍增极上，每一个光电子可使该倍增极发射出许多额外次级光电子，这些次级光电子又被加速轰击到第二个倍增极上，使第二倍增极又发射出更多新的光电子。这个过程继续重复下去，直到最后一个倍增极。最终这些经倍增了的电子被集中到阳极上去，产生较强的电流。由于所产生的电子流每经过一个倍增极便被放大一次，因此这种光电管称为光电倍增管。但是，光电倍增管测强光时，光电流与光强度不成直线关系，并且阴极和倍增极容易疲劳，使灵敏度下降。
光电倍增管的放大倍数，主要取决于电极间的电压。电压越高，放大倍数就越大。所产生的电流从阳极输出，经过负载电阻
（3)阵列型光电检测器 近年来光学多道检测器如光二极管阵列检测器已经装配到紫外－可见分光光度计上。光二极管阵列是在晶体硅上紧密排列一系列光二极管，每个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝。两个二极管中心距离的波长单位称为采样间隔，因此在二极管阵列分光光度计中，二极管数目愈多，分辨率愈高。有的阵列型光电检测器由1024个二极管组成阵列，在极短的时间可在190～820nm范围内获得全光光谱。
5.显示系统(display system) 显示系统是将检测器输出的信号经处理转换成透光度和吸光度再显示出来。显示方式有表头显示、数字显示等。有些仪器可直接读取浓度，配有计算机的可进行测定条件设置、数据处理、结果显示及打印。
二、分光光度计的类型
分光光度计的分类方法有多种，若按波长类别分，有单波长分光光度计和双波长分光光度计；按光束类别分，有单光束分光光度计和双光束分光光度计；按工作波长范围分，有可见分光光度计、紫外及可见分光光度计、红外分光光度计。
1.单波长单光束分光光度计 此种光度计从单色器出来的一束单色光进入吸收池后，透射出来的光进入检测器被检测，所得的电信号经放大后由指示器指示出来。
常用的721型分光光度计属于单波长单光束型，其光学系统示意图如图4-7所示。
图4-7 721型分光光度计光学系统示意图
由光源发射的连续光，经聚光透镜和平面反射镜转900后再经入口狭缝进入单色器内，狭缝正好位于准直镜的焦平面上，照射到准直镜上的入射光被准直镜反射后变成一束平行光射到背面镀铝的棱镜上被色散，由棱镜色散后出来的光线再经准直径的反射，会聚于出口狭缝上，进入吸收池后，其透过光照射到光电管上产生电流，经放大后由显示系统读数。
722型光栅分光光度计采用钨卤素灯作光源，光栅作色散元件，数字显示，该仪器不仅可读取
751G型分光光度计是紫外及可见分光光度计，其光学系统示意图如图4-8所示。通过左右摆动灯箱内的凹面反射镜，可以使来自钨灯或氢灯的连续光射到平面反射镜上，再被平面镜反射至入口狭缝而进入单色器内。其它光路与721型分光光度计类似。仪器设有氢灯和钨灯两种光源灯，进行紫外吸收光谱测定时，用氢灯作光源，用GD-5紫敏光电管（适用波长范围200～625nm)作受光器；进行可见吸收光谱测定时，则用钨灯作光源，用GD-6红敏光电管（适用波长范围625～1000nm)作受光器。该仪器的狭缝在0～2.0mm范围内可调。
图4-8 751G型分光光度计光学系统示意图
752型光栅分光光度计其光源与751G相同，它采用光栅作色散元件，用国产端窗式多碱阴极光电管（适用波长范围190～860nm)作受光器，故能在紫外及可见光谱区域内进行检测。采用数字显示，并可以直读浓度值。
2.单波长双光束分光光度计 此类光度计的工作原理如图4-9所示。由图看出，从单色器出来的光强度为I0的一束单色光通过切光器（也叫斩波器)分解为两束强度相同的光束，交替通过参比池
图4-9 单波长双光束装置示意图
与单光束分光光度计比较，双光束分光光度计具有不受光源瞬间波动影响的优点。推导说明如下：
设有光源发出的入射光强度为
根据朗伯-比尔定律
设 则
（4-11)
式中消去了I0，可见，光源的瞬间波动不影响A值。
3.双波长分光光度计 双波长分光光度计装有两个单色器，光源发出的光分别由两个单色器得到两个波长的单色光。一般的双波长分光光度计，既能以双波长单光束方式工作，也能够以单波长双光束方式工作。
双波长分光光度计的工作原理如图4-10所示。由光源发出的光分两路进入第一单色器和第二单色器，色散后射出两束不同波长的单色光
图4-10 双波长分光光度计光学系统示意图
双波长分光光度计以单波长双光束方式工作的原理如图4-11所示。来自光源的光有一束被光闸档光板档住，不能进入单色器，只有一束光进入单色器，经色散后，一束光强度为
图4-11 双波长分光光度计以单波长双光束方式工作的光学系统示意图
采用双波长分光光度法，通过适当选择两个波长，可以对吸收光谱相互重叠的混合物分别定量，也可测定背景吸收较大的样品，提高了测定的选择性，扩大了分光光度法的应用范围。
第六节 分光光度法反应条件和测量条件的选择
进行可见分光光度法测定时，由于大多数物质吸光系数都很小，难以直接测定，必须先用适当的试剂与试样中的待测组分反应，把它转变成吸光系数较大的有色化合物，然后进行测定。这种使待测组分转变成有色化合物的反应，叫做显色反应，所用的试剂称为显色剂。显色反应的优劣对分析测定的灵敏度及准确度有很大影响。另外，为了得到较好的测量灵敏度和准确度，也必须注意选择适宜的测量条件。
一、显色反应及其条件的选择
（一)显色反应及要求
1．显色反应 显色反应的类型有配位（络合)反应、偶合反应、氧化还原反应等，其中配位（络合)反应应用较广。
2．显色反应的要求：
（1)待测组分应定量地转变成有色化合物，二者有确定的化学计量关系。
（2)反应生成的有色化合物的组成恒定、稳定，符合一定的化学式，且摩尔吸光系数要大（应在104以上)以使测量的灵敏度高、重现性好、误差小。
（3)有色化合物与显色剂的颜色要有明显的差别，即显色剂的emax与生成物的emax差别要大。这样显色时的试剂空白值较小。
（4)反应选择性好，干扰少，或干扰易消除。
（二)显色反应条件的选择
影响显色反应的因素比较多，如显色剂用量、溶液酸度、显色温度、显色时间、共存离子的干扰等，在选择好反应体系后，要对影响因素进行试验，通过试验确定显色反应条件。
1．显色剂的用量 显色剂与待测组分转变成有色化合物的显色反应可表示如下：
（待测组分) （显色剂) （有色化合物)
上述反应在一定程度上是可逆的。为了保证反应尽可能地进行完全，必须加入过量的显色剂。但有时过量太多，会使配合物组成改变，导致颜色减退，对测定不利。例如，用显色剂SCN-来测定Mo5+时，
浅红色 橙红色 浅红色
当SCN-适量时生成橙红色的Mo（SCN)5，若SCN-过量太多，就会生成浅红色的Mo（SCN)6-，使吸光度降低。有些干扰物质在显色剂过量太多时，就会与其产生副反应，干扰测定。此外，不少显色剂本身带有颜色，若用量过多，常使空白值增大。
显色剂用量可通过实验确定。图4-12为吸光度与显色剂加入量的关系。由图可以看出，用量在X1ml至X2ml之间比较适宜，因为此时的吸光度值较大且已达到恒定。
图4-12 吸光度与显色剂加入量的关系
2．溶液的酸度 pH值对显色反应的影响表现在下面几个方面：
（1)对显色剂颜色的影响：不少有机显色剂本身就是酸碱指示剂，在不同的酸度下具有不同的颜色，产生不同的吸收。要选择合适的pH值以使显色剂不干扰测定。
（2)对显色反应的影响：不少显色剂是有机弱酸或弱碱，它们在水溶液中有微弱的离解。显色剂（HR)的离解平衡与显色反应之间的关系如下：
显然，当[H+]增大时，使平衡向形成HR的方向移动，导致[R-]降低，促进有色化合物MR离解，从而影响显色反应。当[H+]太小时，在某些情况下会引起配合物的组成改变，导致配合物的颜色改变，产生不同的吸收。例如，Fe3+与磺基水杨酸（用SS表示)的反应，当pH为1.8～2.5时，可生成紫红色的[Fe(SS)]+；当pH为4～8时，生成橙红色的[Fe(SS)2]-；当pH为8～11.5时，生成黄色的[Fe(SS)3]3-；当pH>12时，将生成Fe(OH)3沉淀而影响有色配合物的生成。
（3)对金属离子存在状态的影响：大部分高价金属离子如Fe3+、Al3+、Th4+、Bi3+等都容易水解。当溶液的pH较高时，会析出沉淀或产生羟基配合物，从而使金属离子浓度降低，影响测定。
因此，在显色反应中，控制溶液的酸度十分重要。而某一显色反应适宜的酸度应通过实验来确定。方法是固定溶液中待测组分和显色剂的浓度，在不同的pH条件下进行显色，分别测定溶液的吸光度，作
3．显色温度 一般显色反应在室温下就能迅速进行完全，而有的显色反应需要加热至一定的温度才能完成反应。合适的显色温度必须通过实验来确定，绘制
4．显色时间 各种显色反应速度不同，各有色化合物的稳定性也不同，显色溶液达到色调稳定、吸光度最大所需的时间有长有短，因此，必须通过实验确定适宜的显色时间。其方法是配制一份显色溶液，从加入显色剂开始计时，每隔几分钟测定一次吸光度，然后绘制
5．干扰的消除 分光光度法测定的样品组成一般比较复杂，样品溶液中的共存离子若本身有颜色，或它能与显色剂生成有色化合物等都将对测定带来干扰。干扰的消除方法主要有：
（1)加入掩蔽剂，使其与干扰离子生成无色配合物以消除干扰。例如，用丁二酮肟测定镍时，可用柠檬酸作掩蔽剂以消除铁的干扰。
（2)加入氧化剂或还原剂，使其与干扰离子发生反应从而改变干扰离子价态以消除干扰。例如，用铬天青S测定铝时Fe3+干扰，可加入抗坏血酸使Fe3+还原为Fe2+消除干扰。
（3)选择适宜的显色条件，如控制溶液的酸度，使干扰离子不与显色剂作用而消除干扰。例如执业医师，用磺基水扬酸测定Fe3+时，Cu2+与试剂生成黄色配合物则干扰测定。但控制pH在2.5左右，Cu2+则不与试剂显色，从而消除Cu2+的干扰。
（4)分离干扰离子，若采取上述几种方法不能消除干扰时，可采用沉淀或溶剂萃取等分离方法以消除干扰。
此外，溶剂有时对显色反应也有影响，应根据具体情况，选择适宜的溶剂，以提高显色反应的灵敏度或显色速度。
二、测定条件的选择
（一)测量波长的选择
一般是根据待测组分的吸收光谱,选择最大吸收波长lmax作为测量波长。因为在
（二)吸光度读数范围的选择
任何分光光度计都有一定的测量误差，即光度误差。光度误差是指读数误差为单位百分透光度（即)时所引起的浓度相对误差（
)。在不同吸光度范围内,读数所引起的光度误差的大小不同。因此,应在光度误差较小的范围内读数。光度误差可由光吸收定律导出：
根据光的吸收定律
（4-12 )
微分得
以有限值表示 （4-13)
式4-13除以式4-12得
即浓度相对误差为 （4-14)
式4-14中，不相同。设
时,根据式4-14可计算出不同
，所得数据列于表4-2中。
表4-2 不同(假定
)
| T% | 95 | 90 | 80 | 70 | 65 | 60 | 50 | 36.8 | 30 | 20 | 15 | 10 | 5 |
| A | 0.022 | 0.046 | 0.100 | 0.155 | 0.188 | 0.222 | 0.301 | 0.434 | 0.523 | 0.699 | 0.823 | 1.000 | 1.301 |
|
| 20.5 | 10.5 | 5.6 | 4.0 | 3.6 | 3.3 | 2.9 | 2.7 | 2.8 | 3.1 | 3.5 | 4.3 | 6.7 |
* (%) 数值前的 ± 号从略。
将对T%作图得一曲线，如图4- 13所示。
图4-13 相对误差与百分透光度的关系
由表4-2和图4-13 可以看出，。为得到较高的测量准确度,A应在0.2～0.8范围内读数。在实际分析时,可通过控制溶液的浓度及选择适当厚度的吸收池使
3.空白溶液的选择 空白溶液(blank solution)也称参比溶液(reference solution)。测量试液的吸光度时,先用参比溶液调节透光度为100%,以消除溶液中其它成组分、吸收池和溶剂对入射光的反射和吸收所带来的误差。
空白溶液有下列几种,必须根据试样的不同进行选择。
（1)溶剂空白 当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收,而其它组分均无吸收时,可用纯溶剂作参比溶液,称为“溶剂空白”。
（2)试剂空白 如果除待测组分外,显色剂和其它试剂在测定条件下也有吸收时,则取与测定试液时所用的显色剂和其它试剂作为参比溶液(只是不加待测组分),称为“试剂空白”。
（3)试样空白 如果只是试样基体有色,而显色剂无色,并且也不与试样基体显色时,则用不加显色剂的试样溶液作为参比溶液,称为“试样空白”。
（4)平行操作空白 为了抵消在分析过程中引入的干扰物质的影响，可用不含待测组分的试样或溶剂或蒸馏水按照与试液完全相同的分析步骤进行平行操作,然后以所得的溶液作为参比溶液,称为“平行操作空白”。也常以其它空白溶液为参比溶液,测定出平行操作空白溶液的值,常称空白值,计算时从试液的测定值中再减去这个空白值。
第七节 定性及定量分析方法
一、定性分析
利用紫外-可见分光光度法对有机化合物进行定性分析时，需将待测试样和标准品用相同的溶剂配成浓度相近的溶液，以相同的条件分别测定它们的吸收光谱，然后比较两者吸收光谱图的一些特征，如：吸收峰数目和形状、最大吸收波长、摩尔吸光系数等,若两者非常一致,就可以基本上认为它们是同一种物质。如果得不到标准品,也可以与文献上的标准图谱进行对照、比较，但要注意其测定条件必须一致。
需要说明的是有机化合物的紫外吸收光谱的吸收带宽而平坦，并且数目也不多，利用紫外-可见分光光度法对化合物进行定性分析时有一定局限性。当有机化合物的结构及性质相近时，它们的吸收光谱非常相似甚至相同；即使它们的结构有差异，但分子中含有相同的生色团时，吸收光谱的形状基本相同。所以当吸收光谱相同时，也有可能不是同一种化合物，此时需借助其他方法进一步鉴别证实。若两个化合物吸收光谱不同时，则可以肯定这两个化合物不是同一种化合物。
二、纯度检测
根据吸收曲线的特征可检查样品中有无杂质。如果待测物质在紫外及可见光区没有明显吸收,而杂质有吸收,那么根据吸收曲线可检查出杂质。例如,若乙醇或环己烷中含有杂质苯,苯在256nm处有吸收峰,而乙醇或环己烷则无吸收,因此,若样品在256nm处有吸收峰时说明样品含有杂质苯。
另外,根据摩尔吸光系数也可检查有无杂质。若待测物质有较强的吸收而所含杂质在此波长下基本无吸收,杂质的存在将使待测物质的摩尔吸光系数降低,反之亦然。
三、定量分析
紫外-可见分光光度法主要用于定量分析，定量依据是Lambert-Beer定律。方法有：
1. 标准曲线法 配制一系列（5～7个)不同浓度的标准品溶液，在待测物质的
用同样方法配制待测试样的溶液，在相同条件下测定其吸光度
2. 直接比较法 在相同条件下配制标准溶液和待测试样溶液，浓度宜相近，以减少误差。然后分别测定它们的吸光度。根据吸收定律：
因K
（3-15)
此法比较简便，但误差较大。分析时使cs与cx尽可能的接近，以提高测定结果的准确性。
3. 双波长分光光度法 对于多组分混合物的定量分析，若组分的吸收峰相互重叠，采用单波长单光束或单波长双光束分光光度法测定时，处理结果时必须解联立方程式，比较麻烦费时，误差也比较大。对于成分复杂、背景吸收较大的试样溶液，单波长分光光度法则无法测定。而双波长分光光度法可以同时测定多组分的混合物，不需解联立方程式，也可以测定背景吸收较大的溶液。双波长分光光度法定量分析的理论依据如下：
在双波长分光光度法中，开始时，使交替照射到吸收池的两束波长分别为
(4-16)
式中ε1及
式4-16表明,ΔA与溶液中待测组分的浓度
用双波长分光光度法对两个组分混合物中某个组分的测定,常采用等吸收点法消除干扰。等吸收点法是指在干扰组分的吸收光谱上,选两个适当的波长λ1和
选择
以测定阿司匹林中水杨酸的含量为例说明等吸收点法。先分别测定阿司匹林(d)和水杨酸(e)在纯品状态时吸收光谱,如图4-14所示, 曲线S表示混合物的吸收光谱。在干扰组分阿司匹林的吸收曲线d上选定有利于测定的两个等吸光度的波长
混合物在
混合物在
上式说明,水杨酸在
如果要测定阿司匹林的含量，则把水杨酸作为干扰组分，这时必须在水杨酸的曲线上另行选择有利于测定的两个等吸光度的波长
图4-14 两组分混合物吸收光谱用作图法选择
4.导数光谱法 导数光谱法(derivative spectroscopy)是解决干扰物质与待测物质的吸收光谱互相重叠，消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收的良好定量方法。
（1)基本原理：根据吸收光谱的数据，每隔一个波长小间隔Δ的值。
（4-17)
图13-14 吸收光谱（a)及其导数光谱(b-e)～λ曲线，得到的图形为一阶导数光谱。依次可求出高一阶的导数光谱，利用带有微处理机的分光光度计可以直接描绘出吸收光谱及其一阶和高阶导数光谱。以高斯曲线模拟的吸收光谱（称零阶光谱)及其一至四阶的导数光谱如图4-15所示。利用导
数光谱对组分进行定性、定量分析的方法称为导数光谱法。此法尤其在多组分的同时测定、浑浊溶液测定、背景干扰消除及复杂光谱的辨析等方面具有独特的优越性。
图4-15 吸收光谱（a)与导数光谱(b～e)
根据导数的物理意义及图4-15可知，在吸收光谱的极大点处，其奇数阶时导数为零，而偶数阶时导数为极值；在吸收曲线的拐点处，其奇数阶导数为极大或极小，而偶数阶导数为零。随着导数阶数的增加，峰数增加，峰宽度变窄，分辨能力提高，有利于重叠谱带及肩峰的分离和鉴别。
导数光谱法的定量依据，根据Lambert-Beer定律得：
（4-18)
由式（4-18)可知，在一定条件下，吸光度A的n阶导数值与待测组分的浓度c成正比。
(2)导数光谱法定量数据的测量:从导数光谱上选择适宜的导数信号，通常采用几何法测量出定量所需的数据。常用的测量方法有峰-谷法、基线法和峰-零法，如图4-16所示。
图4-16导数光谱法定量数据测量法
1) 峰-谷法 在导数光谱上测量峰与相邻谷之间的距离，该值与待测组分的浓度成正比，如图4-16中a、c所示。此法灵敏度高，较为常用。
2) 基线法 该法又称正切法。在导数光谱上对两个相邻峰作切线，然后测量切线到两峰之间的谷的距离，该值与待测组分的浓度成正比，如图4-16中b所示。
3) 峰-零法 在导数光谱上测量峰至基线间的距离，该值与待测组分的浓度成正比，如图4-16中d所示。
第八节 催化动力学分光光度法
催化动力学分光光度法(spectrophotometry by catalytickinetics)是以催化反应为基础，通过测定催化体系中反应物或产物的吸光度
一、指示反应与指示物质
对于一个化学反应，其反应速率依赖于催化剂（或抑制剂)的浓度，若利用此反应可以测定催化剂（或抑制剂)的量，这种化学反应称为指示反应。指示反应中的反应物和生成物称为指示物质。如碘离子催化Ce(Ⅳ)氧化As(Ⅲ)生成Ce(Ⅲ)和As(Ⅴ)的反应，此反应可以测定催化剂碘离子的量，该反应称为碘离子的指示反应，Ce(Ⅳ)、As(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)和As(Ⅴ)均为指示物质。催化动力学分光光度法最常用的指示反应是氧化还原反应。常用的氧化剂为H2O2、Ce(Ⅳ)、卤酸盐,还原剂多为有机化合物，催化剂为金属离子。
二、定量依据
设一显色反应的反应速率较慢，在催化剂的催化下速度加快，其催化显色反应为：
若选择产物F为指示物质，根据质量作用定律，速率方程为
(4-19)
式中cA、cB
控制实验条件，使
（4-20)
积分后得
（4-21)
产物F的吸光度与其浓度c催符合Lambert-Beer定律，即
代入式（4-21)得
（4-22)
在实验条件一定时，ε、b为常数，与
（4-23)
式（4-23)即为催化动力学分光光度法的定量依据。
三、定量方法
在具体测定时，常采用固定时间法，此时式（4-23)中
（4-24)
显然，A与c催成线性关系。催化动力学分光光度法多采用快速冷却终止指示反应，标准溶液及待测溶液均在同样的时间内进行，通过工作曲线法求出待测物质
第九节 提高分析灵敏度和准确度的方法
提高分析的灵敏度和准确度的方法主要有示差分光光度法、萃取分光光度法、胶束增溶分光光度法等，介绍如下：
一、示差分光光度法
普通分光光度法用于高浓度或很稀溶液的测定时，因吸光度值太大或太小，超出了适宜的吸光度读数范围而引入较大的光度误差。若用示差分光光度法（简称示差法),由于扩展了读数标尺,因而提高了测定的灵敏度和准确度,减少了误差。示差法可分为高浓度示差法、低浓度示差法和最精密示差法三种。高浓度示差法的原理如下：
以比待测溶液浓度（
后式减去前式得
(b为一定值)(4-25)
显然,△A与△
图4-17 高浓度示差法标尺扩展原理图
二、萃取分光光度法
萃取分光光度法是溶剂萃取与分光光度法相结合的一种分析方法。本法先将待测组分的配合物用有机溶剂萃取,然后在萃取后的有机相中进行分光光度测定。萃取对待测组分具有富集作用,还可消除干扰离子,使分离和测定在较简单的一些操作步骤中结合进行,在一定程度上加快了分析速度,提高了方法的灵敏度和选择性。
三、胶束增溶分光光度法
研究发现,在二元配合物中加入某些长碳链的季胺盐或烷基吡啶盐、聚乙稀醇等表面活性剂,可与金属离子以及显色剂形成三元胶束状配合物。由于这种季胺盐的长碳链具有疏水性,而季胺盐分子之间又存在吸引力,因此,在水溶液中逐渐聚集成为几十个分子组成的胶体质点,称为胶束。胶束能使原来溶解度较小的物质在溶剂中的溶解度增加。同时,胶束还可促进高配位数的三元胶状配合物的生成,新生成的胶状三元配合物的吸收峰常发生红移,从而使测定的灵敏度显著提高。另外，还可以改变pH对配合物的影响，使显色反应的pH范围变宽，条件易于控制，这种借助表面活性剂的胶束增溶作用,而以分光光度法测定金属离子的方法,称为胶束增溶分光光度法。
分析化学中常用的表面活性剂有氯化十六烷基三甲铵(CTMAC)、溴化十六烷基三甲铵(CTMAB)、溴化十六烷基吡啶（CPB)、溴化十四烷基吡啶(TPB)、溴化羟十六烷基三甲铵(CTM)等。
第十节 紫外-可见分光光度法的应用示例
紫外-可见分光光度法在医药卫生领域中应用相当广泛，如用于大气、饮水、食品、药物、生物材料等样品的分析等。下面介绍几个有关定量分析的实例：
一、二硫腙法测定尿中微量镉
镉不是人体必需的微量元素，婴儿出生时体内并没有镉，以后从空气、饮水和食物中摄入微量镉。有文献报道，人体内镉的总含量约有30mg，其中三分之一积于肾脏。健康人尿液每升中含镉量少于12.7mg。接触镉化合物者,尿液及血液中镉含量增加,在急性镉中毒时,镉含量可显著增加。尿液和血液中镉含量的检测,可以作为镉中毒参考数据之一。
常用二硫腙法测定镉离子。将尿液标本处理后,于碱性溶液中应用二硫腙三氯甲烷溶液与镉离子反应,生成红色二硫腙镉配合物。二硫腙镉不溶于水,可溶于三氯甲烷中,故用三氯甲烷萃取后在有机相中进行分光光度法测定。lmax=520nm, ε=8.56×104。用本法测定尿镉干扰较少，但应严格控制溶液酸度，从反应式中可以看出，酸性增强，将促进配合物离解，影响测定结果。
二、苯酚的分光光度法测定
苯酚俗称石炭酸，具有挥发性和腐蚀性。苯酚能以蒸气和液体形式经呼吸道、皮肤、粘膜侵入机体；另外，酚是蛋白质在机体内代谢的产物。因此，无论在血液或尿中都有酚的存在。据有关资料报道，接触苯者尿中苯酚含量增高，故测定尿中苯酚含量对评价苯吸收有一定参考价值。
苯酚可溶于在近紫外区不产生吸收的饱和烃、醇、醚等有机溶剂，因此，可借助这些有机溶剂把苯酚从水溶液中萃取出来，进行分光光度法测定，lmax=272nm。
苯酚也可采用4—氨基安替比林可见分光光度法进行测定，其原理为：
苯酚与4-氨基安替比林在碱性（pH=8～10)介质中与氧化剂铁氰化钾作用，生成的红色安替比林染料，可用其水溶液直接进行分光光度测定，或者用三氯甲烷萃取后再进行分光光度测定（lmax =460nm )。
三、分光光度法测定人血清或尿中的无机磷
正常人血及尿中均含有无机磷。血清中无机磷（简称血清磷)正常值成人为0.79～1.61mmol/L,儿童为1.45～2.10mmol/L。尿中无机磷(简称尿磷)正常值为16.13～41.94mol/L 24h。若患有甲状旁腺功能减退、肾功能衰竭,则血清磷增高而尿磷降低；若患有甲状旁腺功能亢进、肾小管变性病变,则血清磷降低而尿磷增高。故测定血清磷或尿磷,在临床上具有重要意义。测定原理为：
血清或尿样经三氯乙酸沉淀蛋白质后而得的无蛋白滤液中加入钼酸铵试剂时,无蛋白滤液中的无机磷与钼酸铵[Mo（VI)]反应,生成磷钼酸铵。用氨基酚磺酸还原磷钼酸铵,生成一种钼(V)杂多酸类的“钼蓝”。
7 PO43- +12 (NH4)6Mo7O24 + 36 H2O→7(NH4)3PO4·12 MoO3 + 51 NH4＋+ 7 H2O
(NH4)3PO4·12MoO3 + 氨基酚磺酸还原溶液 → Mo(V) 杂多酸 (蓝色)
溶液中蓝色的杂多酸可用分光光度法在波长为690 nm下进行测定，从而计算出血清或尿液中无机磷含量。
（张洪权 吴拥军)
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