实验二十五 核酸探针和分子杂交技术
一、分子杂交技术的基本原理
分子杂交技术是根据两条单链DNA中互补碱基序列能专一配对的原理进行的。若两个退火的单链来源不同(如一个同位素标记的探针DNA加入源于临床标本的DNA中)，这一反应通常称为杂交。所谓探针是指用某种方法标记的DNA或RNA片段，它能用于测定标本中是否存在与之互补的DNA或RNA序列。目前实验室常用的核酸杂交方法包括：Southern印迹法、Northern印迹法、斑点杂交法、原位杂交法等。
1．Southern印迹法(Southernblot) 将待测DNA用限制性内切酶切割后，其片段在琼脂糖凝胶电泳中按分子量大小分离，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移到一固相支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上，再用标记的探针与固着于滤膜上的DNA杂交，最后根据探针的标记方法不同而采用不同的检测方法，确定与探针互补的电泳条带的位置。由于DNA经限制性内切酶在特定位点进行切割，故不仅可检出杂交片段的数量和大小，而且可在一定程度上反映待测DNA的基因组成。
2．Northern印迹法(Northernblot) 与Southern印迹法相似，只不过待测核酸为RNA，由于RNA只有被有效转录才能在Nort中国卫生人才网hern杂交中显示出来，所以此法可作为研究特定基因表达的手段。
3．斑点杂交法(dotblot) 将待测的DNA标本直接点在硝酸纤维素滤膜上，经变性处理后用探针进行杂交。这种方法省去内切酶消化、电泳、转移等步骤，是一种快速、方便的优点。
4．原位杂交法(insitu hybridization) 为核酸杂交技术与细胞学技术相结合的一种特殊检测方法。它在不破坏细胞形态结构的情况下，用标记的探针直接检测切片标本中的核酸。此法不需从细胞中提取核酸，可直接了解细胞内基因的定位及分布情况，最适宜外科活检标本、病理切片标本等，不但能确定有无微生物序列的存在，还可清楚地了解到哪些细胞受到影响。
二、核酸探针的类型及标记方法
1．探针的类型 任何形式的核酸(DNA、RNA)经适当标记后均可作为探针用于杂交，根据核酸的性质可将探针分为以下几类：
(1) 全染色体探针 这类探针制备简便，主要用于细菌的检测，但特异性不如克隆片段探针。
(2) 克隆片段DNA 这是目前使用最多的探针类型，由于克隆片段的特异性可以选择，因而它具有更大的灵活性，而且便于进一步分析DNA结构及发展新的检测技术，如PCR技术。
(3) RNA及其cDNA探针 RNA探针具有与DNA杂交亲和力强、不会发生自身杂交、
未杂交探针易于去除等优点，但探针制备较为费时，产量较低，且易被RNase降解。其cDNA探针则稳定性较好，可用多种方法标记，并且产量较高。
(4) rDNA(rRNA基因)探针 rDNA，即rRNA基因。rRNA是核蛋白体的主要成分，胞内含量丰富。不同菌种其rDNA的核甘酸序列不同，且在进化上十分保守，故可用特异的rDNA探针检测相应rRNA靶序列来确定细菌的种类。
(5) 寡核苷酸探针 为人工合成的短链核苷酸，特异性高，可检出点突变。因其短小、易穿入组织，可用于原位杂交，但同时也由于核苷酸序列短，样品中与之相似的序列较多，造成杂交背景提高或出现假阳性。
2．探针的标记方法 分放射性标记与非放射性记两大类。放射性同位素标记的探针敏感性高，分辨力强，但成本高，操作烦琐、费时，对操作人员危险性大，废弃物难以处理，而且很多同位素半衰期很短，也限制了其标记的探针的寿命。非放射性标记是在核酸链上共价连接半抗原、生物素或荧光素等化学基团，杂交后通过酶底物显色或荧光计检测。非放射性标记探针具有使用周期长，检测程序简单，节省费用，对操作人员健康无威胁等优点，有些探针的灵敏度已达到或接近放射性同位素标记的探针。目前生物素或地高辛标记的探针越来越受到普遍的欢迎。
三、操作过程
血清标本点样
执业兽医【材料】
1．0.45μm孔径硝酸纤维素膜(国产可用混合纤维素酯微孔滤膜)。
2．加样器、抽滤板。
3．试剂 溶液I：1mol/LNaOH；溶液Ⅱ：0.6mol/LTris·HCl(pH7.4)；溶液Ⅲ：pH7.4，3.0mo1/LNaCl；0.5mol/L Tris·HCl；溶液Ⅳ：2xSSC(0.3mol/LNaCl，0.3mol/L枸橼酸钠)。
【方法】
1．取上述滤膜用溶液Ⅳ浸透，置抽滤板上，按水泵减压法缓慢抽滤。
2．将膜置液I上变性，30min后，用溶液Ⅱ、Ⅲ分别中和，80℃干烤2h以固定核酸(此时为单链)。
探针制备
【材料】
1．缺口翻译(NickTranslation)试剂：缓冲液、dNTP混合物(如同位素标记者为32P-dATP，则加入dCTP，dGTP及dTTP)、同位素标记dNTP(加dATP)、DNA酶I、DNA多聚酶I。
2．SephadexG50柱、闪烁计数器、待标记病毒DNA。
【方法】
1．取lμg待标记病毒DNA，加入同位素标记的dNTP，补充未标记的其他dNTP，加入DNA酶I(打开DNA链上缺口)及DNA多聚酶I(同时将各dNTP进行聚合，以一条链为模板，聚合另一条相应互补链)，从而使病毒DNA标上同位素。14℃水浴2h使反应完成。
2．加入终止反应液后，上SephadesG50(葡聚糖柱)，以分离聚合的DNA链与游离的小分子dNTP。第一峰为标记探针，后峰为游离dNTP。
3．用闪烁计数器计算标记的cpm数。
预杂交及杂交
【材料】
1．厚塑料纸，封口机。
2．预杂交液：甲酰胺SSC,Deinhardt液、低分子量DNA、缓冲液。
3．杂交液：预杂交液、硫酸葡聚糖及煮沸后迅速冷却的探针DNA(使成单链)。
【方法】
1．在三面封口的塑料袋中加入已制备好的有样品的滤膜。加入预杂交液，赶去气泡。封口后，42℃水浴振摇以预杂交6～4h。
2．弃去预杂交液，加入杂交液，封口后，42℃振摇杂交24～6h。
3．倒去杂交液，用高盐、低盐洗液洗涤滤膜。
4．包X光片，置-70℃曝光。经一时间后，取出X光片定影、显影。
