免疫学实验指导-实验二 免疫标记技术

第二部分  免疫标记技术

免疫标记技术(immunolabellingtechniques)是用特定的物质标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应。可借助各种仪器观察结果或进行自动化测定，可在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对液体中的抗原、半抗原或抗体进行定性和定量测定。由于标记物的应用，免疫标记技术在特异性、敏感性、精确性及应用范围等方面大大优于一般的免疫血清学方法。

实验一  酶免疫技术

酶免疫技术是以酶作为标记物的免疫测定方法，利用酶的高效催化作用提高检测的敏感度。根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物，酶免疫技术分为均相和异相，医学检验中常用的酶免疫技术均为异相。

酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA)是一种用酶标记抗原或抗体检测相应抗体或抗原的方法。此法将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶促反应的专一性、敏感性有机地结合起来，可检测体液中微量的特异性抗原或抗体。本方法具有敏感性高、特异性强、操作简单、易观察结果、便于大规模检测等特点，目前已广泛应用于医学和生物学的许多领域。主要有双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法、中和法等模式。本实验介绍在乙肝“两对半”检测中应用的酶联免疫吸附试验间接法和双抗体夹心法。

一、间接法(间接ELISA)

 【原理】

  将抗原结合在微量滴定板上，利用酶标记的抗抗体来检测标本中与滴定板上抗原结合的抗体，形成抗原－抗体－酶标抗抗体复合物，再加入酶特异性底物，即可出现颜色反应。该法是检测抗体最常用的方法之一，它的优点是制备出一种酶标抗体，就可适用多种抗原抗体对的检测。

 【材料】

  1．抗原  乙肝疫苗(含HBsAg)。

  2．抗体  以含有和不含有抗HBs的IgG 的人血清分别作为阳性和阴性对照血清，另取待检者血清为待测血清。

  3．酶标抗抗体(二抗)  辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(HRP－羊抗人IgG抗体)。

  4．试剂  包被液：pH 9.6 碳酸盐缓冲液；洗涤液：含0.5％吐温-20的pH7.4、0.02M 磷酸盐缓冲液；稀释液：pH7.4、0.02M 磷酸盐缓冲液；底物液：10ml pH 5.0磷酸－枸橼酸缓冲液加入邻苯二胺4mg、30％H₂O₂ 5μl；终止液：2M H₂SO₄。

  5．酶标检测仪、微量加样器、微量滴定板等。

   【方法】

 1．包被  用包被液稀释乙肝疫苗抗原至预试验确定的工作浓度，加入聚苯乙烯微量滴定板中，每孔100μl；设正常抗原对照，4℃过夜。

  2．洗涤  用洗涤液洗涤3次，每次3min，甩净，拍干。

  3．加血清  取待检血清，加入滴定孔中，每孔100μl，同时设阴、阳性及空白对照。37℃孵育1.5～2h，洗涤3次，方法同上。

  4．加酶标抗抗体  稀释酶标抗抗体至工作浓度，每孔加100μl，37℃1h，洗涤3次。

  5．加底物  每孔加底物液50μl，37℃避光孵育30min后，加2M H₂SO₄终止反应，每孔50μl。

  【结果】

1．目测法  与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅作出判断(阳性呈棕黄色)。

2．测吸光值(A值)  用酶标检测仪测定各孔A值，以P/N≥2.1为阳性，P/www.med126.comN＜2.1而≥1.5为可疑，P/N＜1.5为阴性。

    待测孔A值－空白孔A值

P/N值＝

阳性对照孔A值－空白孔A值

   【注意事项】

1．各种试剂最好临用前用新鲜的双蒸水或三蒸水配制。

2．加样最好使用定量准确的微量加样器，将液体加在孔底，避免加于孔壁上方，防止气泡产生。

3．目测法易受主观因素影响，检测吸光值法受仪器质量和ELISA板质量的影响。

4．每次试验设阳性血清、阴性血清、酶标抗抗体及空白对照。

5．不同的商品试剂盒结果判断值各异，应仔细阅读说明书。

二、双抗体夹心法

   【原理】

与间接法基本相同，不同之处在于包被特异性抗体，加待测抗原孵育后，再加入酶标记的相同抗体，形成抗体－抗原－酶标抗体复合物，最后通过酶与特异性底物相互作用，出现颜色反应，根据颜色深浅，可判断抗原量的多少。是检测抗原常用的方法，但需针对不同抗原制备不同的酶标抗体。

   【材料】

1．抗原  以含有和不含有HBsAg的人血清分别作为阳性和阴性对照血清。

2．抗体  抗HBs。

3．酶标抗体  辣根过氧化物酶标记的抗HBs。

4．其它试剂、器材同间接法。

   【方法】

1．包被  用包被液将抗HBs稀释至工作浓度，加入聚苯乙烯微量滴定板中，每孔100μl，4℃过夜。

2．洗涤  用洗涤液洗涤3次，每次3min，甩净，拍干。

3．加待测抗原  稀释待检血清，加入滴定孔中，每孔100μl，同时设阴、阳性对照。37℃孵育1.5～2h，洗涤3次，方法同上。

4．加酶标HBs抗体  稀释酶标抗体至工作浓度，每孔加100μl，37℃1h，洗涤3次。

5．加底物  每孔加底物液50μl，37℃避光孵育30min后，加2M H₂SO₄终止反应，每孔50μl。

  【结果】

判断与间接法相同。

   【注意事项】

同间接法

   【思考题】

1．酶联免疫吸附试验间接法和双抗体夹心法的原理是什么？

2．为什么说“洗涤”是一个关键步骤？洗涤不彻底有什么影响？洗涤的目的是什么？

实验二  免疫荧光技术

   免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是以荧光物质作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合，但不影响其免疫学特性，根据荧光的存在与否来检测抗原或抗体。该技术多用于抗原的定性与定位，在荧光显微镜下可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位；也可与标准品对照而得到分析物的浓度而进行定量。

一、直接免疫荧光法检测B细胞的mIg

【原理】

B细胞表面携带的mIg，为B细胞的特异性表面标志，能与相应抗体特异性结合，故可用荧光标记的抗全Ig血清作免疫荧光染色镜检。由于B细胞在分化过程中的每个阶段均具有Ig的标志，故该法可检出全部B细胞。每一个B细胞表面可携带不同类Ig，即mIgM、mIgD、mIgG、mIgA或mIgE，如分别用单价荧光抗Ig血清染色，则可鉴别带不同类Ig的淋巴细胞。人外周血B细胞以携带IgM为主。凡与荧光标记抗体结合的细胞，在荧光显微镜下细胞膜可呈现荧光，即为mIg阳性细胞，也就是B淋巴细胞。同时用普通光源照明，计数该视野的淋巴细胞总数，根据发荧光与不发荧光细胞的计数，可计算出mIg阳性细胞或带各类mIg细胞的百分数。

直接免疫荧光法的优点为：⑴由于在反应中只有两种因子参与，结果判断较简单；⑵特异性强，与其他抗原交叉染色较少；⑶操作步骤少，方法简便、省时。其缺点有：⑴敏感性较差；⑵一种标记抗体只能鉴定一种抗原；⑶不能用于鉴定未知抗体。

【材料】

1．试剂  荧光标记的兔或羊抗人Ig血清、受检者静脉抗凝血、RPMI1640完全培养液、5%小牛血清Hanks液、淋巴细胞分离液（比重1.077±0.001)、0.2%台酚蓝染液。

 2．器材  清洁载玻片、盖玻片、血球计数板、计数器、毛细吸管、试管、显微镜、荧光显微镜。

【方法】

1．取静脉抗凝血4ml，加入Hanks液4ml，混匀后用毛细吸管滴加于已装有4ml聚蔗糖泛影葡胺淋巴细胞分离液面上(在1.5×15cm试管内)，立即2000rpm20min，弃去上清液后再用Hanks液洗涤一次，弃上清，用RPMI1640完全培养液悬浮细胞，计数白细胞数，并用0.2%台酚蓝染液测细胞活力，活细胞数应大于95%。用RPMI1640完全培养液将细胞悬液配成5×10⁶/ml。

2．在试管中加入配制好的淋巴细胞悬液0.1ml，再加入荧光抗体0.1ml，放置4℃作用30min。

3．加已37℃预温的含5%小牛血清Hanks液2～3ml，离心1500rpm ，10min。如此重复洗涤2次。

4．取沉淀细胞滴加在载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜暗视野下观察。

【结果】

一般先用暗视野计数荧光阳性细胞数，继用普通光源计数同一视野中淋巴细胞总数。每份标本计数200个淋巴细胞，着荧光者为B细胞，计算其百分率，同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算B淋巴细胞的绝对值。

免疫荧光染色细胞的形态和类型：凡呈现微弱、均匀一致的暗淡荧光者为非B细胞；凡细胞呈现较强荧光，有明显的细胞轮廓，并可见环状或两个以上斑点或在细胞的一侧见有帽状结构的为mIg阳性细胞—B细胞。

正常值：正常人外周血中mIg阳性细胞均值±SD为11.2±1.5%。

二、间接免疫荧光法检测痢疾杆菌

间接免疫荧光法是目前最常用的方法。首先用已知未标记的抗体(第一抗体)与待检抗原反应或用未知抗体与已知抗原反应，反应一定时间后，洗去未结合的抗体，再与标记的抗免疫球蛋白(二抗)反应。在第一步反应中，若抗原抗体发生了反应，则抗体被固定在标本上，那么第二步反应中标记的抗体(二抗)则可与第一步反应形成的抗原抗体复合物中的抗体发生反应，这样可以通过二抗的示踪，对标本中未知抗原或抗体进行鉴定。其优点为：⑴ 敏感性较高，是直接法的5～10倍；⑵用一种标记抗抗体，就能与一种以上的相应抗体配合，鉴定多种未知的抗原或抗体；⑶既能鉴定未知抗原，又能鉴定未知抗体。其缺点有：⑴在反应中有多种因子参与，容易产生非特异性染色，结果判断有时较困难；⑵操作步骤多，费时。

本试验用已知抗福氏痢疾杆菌IgG与待检抗原反应，一定时间后，洗去未结合的抗体，再与标记的抗IgG抗体反应。通过观察荧光有无鉴定细菌是否为福氏痢疾杆菌。

【材料】

1．灭活的福氏痢疾杆菌、灭活的伤寒杆菌。

2．一抗(兔抗福氏痢疾杆菌IgG)、荧光标记的二抗(羊抗兔IgG抗体)。

3．固定剂：4％多聚甲醛、乙醇等。

4．洗涤液和抗体稀释液(pH7.4 PBS-Tween 20)。

  【方法】

1．将灭活的福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌固定在载玻片上。

2．加入25μl一抗，完全覆盖住玻片上细菌，室温孵育60min；每个检测应包括3组对照：与一抗同一种属、类型的无关抗体组，以检测染色的特异性；未加一抗的对照组，以检测二抗染色的背景；如果可能，用已知阳性样品作为阳性对照组。

3．用洗涤液洗3次，各5min。加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的抗抗体(二抗)25μl，室温孵育20min；标记二抗在使用前，应预试其合适的稀释度。

4．用洗涤液洗3次，各5min。

5．在作好标记的载玻片上滴一滴固定剂(约50μl)，盖上盖玻片并在空气中干燥30min。

6．在荧光显微镜下观察、拍照。

   【结果】

荧光显微镜观察，见到发出明显荧光的杆状细菌为福氏痢疾杆菌。

【注意事项】

1．一抗二抗使用前均应测试其合适的稀释度。

2．防止抗体污染出现假阳性。

3．每次试验前荧光抗体需3000rpm30min，以除去荧光血清中的聚合蛋白。

【思考题】

1．直接免疫荧光法、间接免疫荧光法的原理是什么？

2．直接免疫荧光法和间接免疫荧光法各有何优缺点？ 

实验三  放射免疫分析技术

  【原理】

放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)一般采用竞争结合分析技术。其基本原理为同位素标记的抗原(Ag^*)与待测抗原(或标准品)竞争性结合有限的特异性抗体，最终形成的Ag^*-Ab复合物的量与被测物的含量呈负相关。当抗体的量固定不变时，免疫复合物的形成就受到待测抗原量的制约。如反应体系中待测抗原含量高时，对Ab的竞争结合能力就强，Ag-Ab复合物的形成量就会增加，Ag*-Ab复合物则相对减少；反www.med126.com/shouyi/之，当待测抗原含量低时，对Ab的竞争结合能力弱，Ag*-Ab复合物的形成量即增多。

  Ag*(标记抗原)＋Ab(特异性抗体) Ag*-Ab(标记抗原抗体复合物)

 ＋

Ag(未标记抗原)

   Ag-Ab(未标记抗原抗体复合物)

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)在胎儿生长发育过程中由卵黄囊和肝细胞合成，胃肠管细胞也可合成一部分。出生后逐渐减少，在成人血清中含量极微。原发性肝细胞性肝癌时AFP明显增高，可通过检测其含量协助临床诊断。

本试验将纯化¹²⁵I标记的AFP与样本内AFP混合，使二者竞争结合一定数量AFP抗体，经处理后用γ计数仪计数¹²⁵I标记的AFP与抗体结合的数量。

   【材料】

1．¹²⁵I-AFP、AFP标准品。

2．AFP抗体(第一抗体)、第二抗体(兔抗人Ig)。

3．待测人血清、缓冲液。

4．免疫反应管、微量加样器、γ-射线闪烁计数器等。

   【方法】

1．  按表2-1加入各反应液于免疫反应管中，每份样品均作双份测定。

2．反应  先将反应管37℃温育30min，再放4℃24h。

3．B、F的分离

　　⑴ 自4℃取出后加入第二抗体0.1ml/管，室温放置4h；

　　⑵ 离心3000rpm，15min，沉淀物为已结合的AFP抗原(B)，游离的AFP抗原(F)留在上清液中弃去。

　　4．测定

　　⑴ 各反应管加第二抗体后未离心之前测定总放射性；

　　⑵ 离心弃去上清后，再测定沉淀物的放射性。

表2-1 AFP放射免疫分析加样程序

    5．计算各管的百分结合率

对照管(Bc)的非特异性结合率：Bc＝Bc / (B+F)c×100％

标准品管的百分结合率：B＝B/ (B+F) ×100％－Bc

样品管(Bs)的百分结合率：Bs＝Bs / (B+F)s ×100％－Bc

6．绘制标准曲线  以标准AFP含量为横坐标，标准管百分结合率为纵坐标绘图。

7．计算样品AFP含量。

   【结果】

通常健康成人血清含微量AFP，其值低于25ng/ml。样本结果＜20ng/ml者，可基本排除原发性肝癌的可能性；介于100～350ng/ml之间者，必须进行随访，密切观察AFP的动态变化；350～500ng/ml或含量有明显增高者，必须参考其他实验结果并高度警惕原发性肝癌的可能；500～1000ng/ml且AFP含量在短期内不断升高，原发性肝癌可能性很大，建议作活检；＞1000ng/ml，且近期内含量迅速升高，结合临床可基本诊断为原发性肝癌。

   【注意事项】

1．RIA测定AFP的范围为0～400ng/ml，最敏感段为0～100ng/ml，故受检血清AFP高于400ng/ml时应进行稀释。

2．各种抗原抗体试剂应储存于2～10℃，禁忌冰冻。

3．第二抗体加入反应管温育后，用肉眼检查反应液呈明显絮状沉淀时才能进行离心分离，否则需延长温育时间或增加第二抗体量。

4．严重溶血标本不能使用；血脂会使结果偏高，宜空腹采血。

5．¹²⁵I具有放射性，操作人员应注意防范。废弃物应按有关规定存放。

   【思考题】

1．RIA的原理是什么？该试验主要应用于哪些方面？。

2．试比较RIA、ELISA以及荧光标记技术的优缺点。

实验四  胶体金技术

胶体金免疫结合试验是在酶免疫结合试验的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其特点是单份测定，简单、快速。除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。目前已在临床检测中获得广泛应用。

 氯金酸(HAuCl₄)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径，也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附作用，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白、多肽等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。免疫金标记技术(Immunogold labellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测中。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。

下面以斑点金免疫结合试验为例对金标记技术的应用作简要叙述。本组试验以胶体金为标记物，以硝酸纤维素(NC)膜为固相载体，按间接法、双抗体夹心法等反应模式，通过渗滤或渗移方式完成免疫测定过程。该法可用于检测抗原或抗体，最大特点是简便快速。

一、 斑点金免疫渗滤试验

  【原理】

斑点金免疫渗滤试验(Dot-immunogold filtration assay，DIGFA)，又称滴金免疫法，分间接法或夹心法。间接法测抗体：固定于膜上的特异性抗原＋标本中的相应抗体＋金标记的抗抗体或SPA显色。夹心法测抗原：固定于膜上的多克隆抗体＋标本中待测抗原＋金标记的特异性单克隆抗体显色。以双抗体夹心法测定人尿中HCG为例。选取二株抗HCG不同决定簇的抗体，其中一个用胶体金标记，另一抗体吸附于NC膜表面形成斑点，膜下面垫有吸水材料。标本经滤膜板除杂质后，标本液经NC膜渗滤，膜上抗体捕获HCG，形成免疫复合物。之后加入抗HCG免疫金结合物形成特异性双抗体夹心物。此时胶体免疫金颜色的深浅与标本中HCG含量呈正相关。

   【材料】

1．标本　孕妇尿。

2．试剂 参照标准液(HCG 50mU／m1)、胶体免疫金结合物、洗涤液(pH7.2 ，0.02mM PBS)。

3．器材包被抗HCG抗体的渗滤反应板、试管、微量移液器等。

【方法】

  1．取渗滤反应板，平放于实验台面，于滴孔下分别标明“S”和“C”。

 　 2．在“C”孔内滴加参照标准液6滴，在“S”孔内滴加尿液标本6滴，待完全渗入后，移去孔上滤膜板。

3．每孔加胶体免疫金结合物液3滴于NC膜上，应完全渗入到NC膜中。

4．每孔加洗涤液3滴，待完全渗入后，目测观察结果。

图2-1 DIGFA渗滤装置

【结果】

1．参照标准液孔膜上应有清晰的淡红色斑点出现。

2．若标本滴加孔膜上无红色斑点，或斑点显色浅于参照标准液孔，说明标本中HCG含量低于50mU／ml；如标本孔斑点深于参照孔，则标本中HCG含量大于50mU／ml。

3．若测定标本为强阳性时，可用洗涤液稀释，按同法作测定，稀释至标本斑点与参照孔颜色相当，即可知标本HCG含量(50mU／ml×稀释倍数)。

正常未妊娠妇女尿中不含HCG，或其含量上限为50mU／ml。HCG由胎盘滋养层细胞分泌，为分子量47000的糖蛋白。孕妇妊娠1周后，尿中HCG迅速升高，呈阳性反应。停经后8周左右尿内激素含量达到最高，以后逐渐减低，直至转为阴性。绒毛膜上皮癌、水泡状胎块和睾丸畸胎瘤病人的尿中，HCG均可呈强阳性反应。

   【注意事项】

1．本试验为对比测定法，参照标准液与标本的加入量应尽量一致。

    2．胶体免疫金结合物滴加时，滴瓶应垂直向下，液滴内不含气泡。

二、斑点金免疫层析试验

   【原理】

斑点金免疫层析试验(dot immunogoldchromatographic assay，DIGCA)，又称“一步金法”。以测定尿HCG为例，采用双抗体夹心法。将抗HCG单抗和抗小鼠IgG抗体分别固化于NC膜上，形成测试斑点线和质控参照斑点线。抗HCG免疫金结合物干片紧贴NC膜下端，试纸条两端附有吸水材料。当试纸条下端吸取标本后，液体向上移渗，流经干片时，标本中HCG与免疫金结合物形成复合物。复合物沿NC膜的毛细微孔向前渗移至测试线时，形成双抗体夹心复合物，出现红色反应线条。剩余免疫金结合物继续渗移至质控参照线，与抗小鼠单抗结合呈现出红色质控线条。多余液体继续向前渗移至试纸条上端的吸水物内。本试验最大特点是所有试剂均干化，操作十分简便。

图2-2  DIGCA层析装置

左：正面图　　　　右：纵切面图

1.吸水滤纸　　　  2.固定有抗α-HCG抗体的NC膜

3.冻干金标记的抗α-HCG的玻璃纤维 　4.吸水材料

5.试剂质控区带　   　6.固定的抗α-HCG抗体区带

7.硬质塑料板

  【材料】

1．标本　孕妇尿。

2．主要试剂  “一步金法”早早孕妊娠诊断纸条片。

3．主要器材　尿液收集杯等。

【方法】

  将试纸条下端标志部插入尿液中l0s左右，取出后放平，置室温下3min，目测观察结果。

 【结果】

  若出现二条紫红色线为HCG阳性，若只有质控参照线显示紫红色为HCG阴性(未妊娠)。该法检测的灵敏度为50mU/ml。

 【注意事项】

 1．强阳性尿中HCG含量高，可能不出现质控线或很浅，而仅在反应区显示淡紫色条带。

 2．试纸条不宜插入尿液过深或过浅，插入时间也不宜过长或过短。

 3．孕妇妊娠1周后，尿夜中就能检出HCG，可进行早期诊断。

 4．绒毛膜上皮癌、水泡状胎块和睾丸畸胎瘤病人尿HCG含量可明显增高，应结合临床症状区别。

 【思考题】

1．什么是快速斑点免疫金结合试验，有哪些类型？

2．实验操作过程中应注意什么？

3．尿液HCG阳性有何临床意义？