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嘌呤类药物作用及巯基嘌呤甲基转移酶遗传多态性的研究进展

文章来源:医学全在线 更新时间:2006-5-16 4:54:24 技能论坛

 


  目前研究结果表明,治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的抗嘌呤代谢药物——6-巯基嘌呤(6-MP)和6-巯代鸟嘌呤(6-TG)均是无内在生物活性的药物,必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。而人体一种被称为巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的代谢酶在此类药物代谢和抗白血病作用中起关键作用。此酶是存在于哺乳动物和禽类细胞中的一种细胞内酶,非金属依赖性,能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基的供体和底物结合,特异地催化杂环类和芳香类化合物苯环6-位硫原子的甲基化,其内在底物和主要的生物学功能仍然未完全清楚[1,2],而其DNA编码顺序上某个核苷酸碱基点突变,是造成嘌呤类药物不同强度的细胞毒作用的基础[3]。所以,对于TPMT酶学特点、其遗传多态性的分子生物学机制以及6-MP、6-TG临床关系的研究成为当前研究药代动力学的热点之一。


  1 6-MP和6-TG的代谢[4,5] 6-MP的代谢途径:①由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)催化先形成硫基次黄嘌呤单磷酸盐(TIMP),硫基黄嘌呤单磷酸盐(TXMP),硫基鸟嘌呤单磷酸盐(TGMP),后者经磷酸化后分别形成二磷酸盐和三磷酸盐。后三种物质统称为TGNs,它整合到肿瘤细胞中影响DNA的复制及RNA的表达,发挥抗肿瘤作用。②6-MP,TIMP,TGMP均可由TPMT催化生成甲基化的衍生物6-meMP,6-meTGMP,6-meTIMP,这些甲基化的化合物属于“无活性”的物质,它们能够抑制磷酸核糖焦磷酸化氨基转移酶(PRPP-AT)的活性,后者是细胞重新合成嘌呤步骤中的关键酶,因此,抑制PRPP-AT的活性就阻断了肿瘤细胞遗传信息的表达,从而达到抗白血病的作用。③由黄嘌呤氧化酶催化形成6-硫基黄嘌呤后再形成尿酸也可生成尿酸排出。


  6-TG的代谢途径:①由HPRT催化直接形成硫基鸟嘌呤磷酸化合物(TGNs)发挥抗白血病作用。②也可由TPMP催化生成甲基化的产物如6-meTG,或me-TGMP,达到抗肿瘤的作用。但组织中TPMP对6-TG的催化效力远比6-MP低(约为1/12)[4],故此过程并非6-TG的主要代谢途径。③6-TG由鸟嘌呤脱氢酶催化生成6-硫基黄嘌呤再由黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸排出。


  2 TPMT的酶学特点


  2.1 TPMT的组成结构:由两个具有相同的催化功能单体组成,说明TPMT的结构并非引起遗传多态性的原因。TPMT的分子量大约为30000。通过提取和分析人肾脏组织中的TPMT,发现它由245个氨基酸残基组成。另有人还发现几乎每个依赖SAM的甲基转移酶均含有3个结构保守的序列(motifⅠ,Ⅱ,Ⅲ),分别含24-,12-,12-三个单体结构,估计这些序列为酶结合底物的结构域[6~8]。


  2.2 TPMT的组织分布:人类TPMT首先在肝脏、肾脏中被发现,随后陆续地在胃肠道、肺、脑、血液、胎儿、胎盘等组织中发现。成年人肝细胞的TPMT浓度和血液组织中几乎呈直线相关。第3个月的胎儿即有TPMT的存在,其中第6个月的浓度及活性和新生儿类似,说明TPMT的浓度及活性在人体各组织内,甚至肿瘤组织中均存在密切相关性,测定红细胞中的TPMT浓度即可大致估计其它组织的酶活性[9,10]。


  2.3 TPMT的酶学动力学特征:酶活性随孵育时间、底物浓度、pH值和离子浓度、底物浓度(红细胞浓度)的变化而变化[11]。TPMT最佳孵育时间为60分钟[10],其它参数符合Michaelis-menten曲线。同时,Krynetski等[11]发现在一般组织中(肝、肾等)酶作用最佳pH值为7.5,而血液中为6.7。


  2.4 TPMT的底物及抑制物:Krynetski等做了18种6-MP和6-TG衍生物的酶学实验,包括它们的核苷酸和核糖核酸,描述了它们的反应特性:大多数的衍生物均可作为TPMT的底物,它们的酶促动力学特性均符合Michaelis-menten曲线,发现6-MP比6-TG与酶结合的能力强。在所有前体药物(6-MP,6-TG)和衍生物中,8-羟基-6-MP和6-TG分别是两个药物家系中活性最大者,而它们的核苷酸盐类则是这些化合物中活性最低的,其原因可能是它们较易被水解。Mcleod等[10]发现当化合物中7,9位被烷基化后,其与酶结合的能力有所加强。同时发现前体药物的Km、Vm和Km/Vm值均比其衍生物低,说明6- MP和6-TG并非TPMT的自然底物。另外,6-硒基嘌呤(Selenopurine)及其衍生物也可以作为TPMT的底物,但是它们的Km和Vm值均显著比硫基嘌呤及其衍生物低。黄嘌呤8位上有-OH基者是底物,而2位上有-OH则为抑制物[12]。除2-OH-黄嘌呤外,S-腺苷-L-半胱氨酸、Sinefungin、6-甲基硫基嘌呤、3,4-双甲氧-5-对羟基苯甲酸为TPMT的抑制物[2]。


  3 TPMT的遗传多态性 从人类T84结肠癌患者细胞中提取分析DNA及cDNA寡核苷酸探针筛查文库,发现TPMT基因总长为3.4kb,编码序列总长2.7kb,开放阅读框架含735个碱基。国外多个文献调查显示,大约有89%的人TPMT酶活性>6U/ml pRBC,属于高活性,而11%的人酶活性为1~5U/ml pRBC,属于中度活性。而大约1/300的人活性低于1U/ml pRBC或其活性无法测出。造成这种结果的原因是编码TPMT的核苷酸碱基顺序发生点突变,而是否有染色体易位或丢失尚无文献报道。美国和英国学者已在白种人中发现和克隆出两个点突变位点,分别命名为TPMT*2和TPMT*3。其中前者是核苷酸序列中第238位的鸟嘌呤(G)→胞嘧啶(C),使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)→Pro(脯氨酸),后者是第460位的鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A),第719位的腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G),结果是氨基酸序列第154位的Ala→Thr(苏氨酸),第240位的Tyr(酪氨酸)→Cys(半胱氨酸),这样就造成了酶活性的减低或丧失,从而导致在使用6-MP时形成高浓度的TGNs,引起明显的造血组织细胞毒性,产生严重后果,甚至引起死亡。两种突变类型中,TPMT*3出现的频率占两种类型的70%,而TPMT*2占30%[13,14]。


  4 影响TPMT活性的因素


  4.1 种族特异性:美国弗罗里达州黑种人平均TPMT酶活性为8.64±3.47U/ml pRBC,未发现缺陷患者。而白种人平均为12.3±3.88U/ml pRBC,酶活性的分布比例与前述类似[15]。Mcleod等[16]发现白种人的酶活性平均值为16.8U/ml pRBC,黑种人则为14.4U/ml pRBC(P<0.001)。法国人平均15.4±7.0U/ml pRBC,其TPMT遗传多态性的分布和美国人相同[1]。新加坡的调查显示,健康华人中TPMT的多态性结论和美国人相似,而实际的数值却大大超过了国外报道的结果[17]。挪威Saami人的平均值为17.0±3.3U/ml pRBC,白种人为13.1±2.9U/ml pRBC(P<0.001),而酶活性的分布比例与前面结果相似[18]。同时,他们与韩国合作检测韩国人群的酶活性,其结果也类似[19]。


  4.2 性别:3篇文献报告在白血病患者中女性的酶活性似比男性高,而健康人无明显差别[5,8,20]。其它的文献结果为无显著差异[2,3,17]。


  4.3 年龄:文献提示TPMT的活性与年龄无相关性[9]。


  4.4 红细胞寿命及免疫分型:无相关性[11]。


  4.5 使用6-MP前后TPMT活性:患者在进行化疗时其体内TPMT的活性与用药前相比大约要上升30%,其中以用药前活性最低的患者上升得最快。而用药后约3个月又逐渐回到原来水平,其中下降得最快者是用药期间活性上升最高者[5,11]。


  4.6 慢性疾病:无相关性[11]。


  5 TGNs和TPMT的关系 TGNs和TPMT甲基化是嘌呤类药物治疗白血病的两个重要途径,它们之间的关系可以归结如下:高TPMT活性的人群形成的TGNs量少,甲基化产物多;低活性的人群形成的量多,甲基化产物少。因此,低活性人群TGNs虽然能产生强烈的抗肿瘤作用,但同时也容易产生毒副作用,引起造血组织的致命损伤;而高活性的人群由于体内的TGNs量少,虽然此副作用弱,但出现复发的机率也大[21]。


  6 6-TG和6-MP的临床关系 由于6-TG直接衍生为TGNs,而且临床发现患者在使用6-TG时较少出现造血组织毒副作用及具较低复发性,因此,有人建议以它 替代6-MP。但6-TG可引起门脉高压,与别嘌呤醇合用时引发较高的毒性,而且价格昂贵、半衰期短,所以目前临床医生建议和6-MP按需选择性交替使用[22]。此外,6-MP和6-TG的作用机制也稍有不同,前者作用于细胞周期的G1/S期,而后者作用于S/G2晚期,6-MP使嘌呤再合成受阻,而6-TG则使染色体“变性”,可能引起严重的治疗后期不良反应,故当患者酶活性低时可适当降低药物剂量,有文献报道将剂量降低90%时所产生的疗效和正常剂量无显著差异。另有文献报道酶活性低患者当降低6-MP剂量时如果和甲氨喋呤(MTX)联用可产生较好的疗效。其机制为抑制嘌呤合成后产生大量磷酸核糖焦磷酸盐,后者可以整合到细胞DNA中抗肿瘤。而当患者酶缺陷时应大规模减少剂量或选择换用其它药物。由于大多数患者在治疗前其体内TPMT活性未知,因此,在用药时较难避免造血组织毒性,加大了治疗的难度及影响疗效。此外,输血可能造成测定时的误差,应引起注意[23]。


  7 研究嘌呤类药物和TPMT的意义 进行此项研究的意义在于:①测定6-MP原发性耐药个体,避免患者对药物不敏感,造成维持治疗期的复发,贸然加大剂量同时也易产生毒副反应。②测定TGNs浓度,避免高浓度时患者对药物过度敏感,产生造血组织抑制和肝脏损害,被迫终止维持治疗,使化疗不能长期、规则、正常地进行,从而容易复发。③避免由于造血组织的毒性使得全身免疫能力下降,产生继发感染,引发死亡或其它严重的反应。因此,认识中国人6-MP药代动力学,深入研究TPMT表现型和基因型,了解其遗传多态性的分布和机制,掌握药物代谢过程中的各种数据,就可针对每个患者不同酶活性和TGNs而制定相应的用药方案,使治疗个体化,提高急性白血病尤其是ALL的远期疗效乃至提高长期无病生存率。

参 考 文 献


  1 Tinel m,Berson A,Ersayre D,et al.Pharmacogenetics of human erythrocyte thiopurine methyltransferase activity in French population.Br J Clin pharmac,1991,32:729-734.


  2 Loon VJA,Szumlanski C,Weinshilboum RM,et al.Human kidney thiopurine methyltransferase photoaffinity labeling with sAM.Biochem Pharmac,1992,44:775-785.


  3 Szumlanski C,Otterness D,Her C,et al.Thiopurine methyltransferase pharmacologenetics:human gene cloning and characterization of a common polymorphism.DNA Biology,1996,15:17-30.


  4 Evans WE,Relling MV.Mercaptopurine vs thiopurine for the treatment of acute lymphoblastic leukemia.Leuk res,1994,18:811-814.


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  23 Evans WE,Horner M,Chu YQ,et al.Altered mercaptopurine metabolism toxic effects,and dosage requirement in a thiopurine methyltransferase-deficient child with acute lymphocytic leukemia.J pediatr,1991,119:985-989.

 

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