奶牛新孢子虫病
新孢子虫病（Neosporiasis)是由犬新孢子虫 （ Neospora caninum Dubey，1988)寄生于犬、牛、羊等多种动物细胞内而引起的一种原虫病。该病1984 年由挪威兽医学家Jcerkas在患脑炎和肌炎的幼犬 体内首次发现，1988年Dubey博士将其命名为犬新孢子虫［1］。犬新孢了虫的终末宿主是犬［2］，牛、羊、犬、马、鹿、小鼠等均可作为中间宿主。虽然新孢子虫病是多种家畜共患的一种原虫病，但其对牛的危害尤为严重，主要造成母牛流产、产死胎以及新生儿的运动神经系统疾病，同时该病可垂直传播，带虫母牛可将虫体直接传给新生犊牛，已证实它是造成奶牛工业严重经济损失的一个重要原因。由于我国每年从欧美及周边国家引进大量种牛或商品牛，很可能将本病带入我国。本病防制的关键在于诊断，为此作者就近年国外学者奶牛新孢子虫病诊断方法进行了综述，供同行们参考。以下介绍的是奶牛疾病防治：
1 临床诊断
生前诊断主要依靠临床症状观察。本病一年四季均可发生，但高峰多出现在夏季，感染在母畜间不存在年龄差异，以妊娠6个月以前流产的胎儿血清 阳性比例较高，引起的流产常呈散发性或地方性流行，因此当出现母畜流产，死产，新生儿瘫痪、畸形，共济失调，肌肉萎缩，抽搐或其它运动神经系统疾病 症状时，特别是一群或多群出现此类症状时应怀疑是否为新孢子虫感染［3，4］ 。
2 病原学诊断
2.1 病理组织学检查
根据 N.caninum 的寄生部位，在新生儿的肌肉、脑组织、呼吸道分泌物及皮肤脓包等活组织中均能检查到 N.caninum 。应采集流产胎儿的脑、脊髓、心脏及肝等组织进行常规组织学检查。可见多灶性、非化脓性脑炎、神经炎、心肌炎、骨骼肌炎、肝炎以及细胞浸润等，但要确诊，必须检测到 N.caninum 速殖子和（或)组织包囊［5］ 。
2.2 病原的分离培养
为了分离及培养 N.cani-num 病原，可采集待检动物病料组织，匀浆后皮下接种小鼠、大鼠、小沙鼠、犬、猫、家兔等。接种剂量依 据动物种类不同而不同。发病后采集中枢神经或内脏组织进行特异性检验，也可进行传代接种。 N. caninum 的体外培养已获成功，可在牛肾细胞、Vero细胞等传代细胞系中生长发育，常用牛单核细胞和牛心肺主动脉内皮细胞进行培养。Davison等［6］ （1997)将约10 g新鲜的死胎犊牛脑组织用0.5%的胰蛋白酶匀浆消化后接种到6份Vero细胞上。在 含有5%CO2、95%空气混合物的RPMI-1640培养液中，于37°C 下维持培养。接种后29天在一份培养 液中首次观察到典型的 N.caninum 速殖子。Ya- mane等［7］（1997)采集16头流产胎儿和疑似新孢子 虫病犊牛组织样本，接种于牛心肺主动脉内皮细胞和猴肾细胞培养物中，接种后49天在一份细胞中观 察到 N.caninum 速殖子。这表明病原的分离和体外培养可用于新孢子虫病的特异性诊断。
2.3 免疫组织化学检查虫体
采集病死动物的大脑、脊髓，或肝、肾、胎盘，或其它病变部位，切片后用免疫组织化学染色。犬 N.caninum 血清可使虫体特 异性着染，而弓形虫和其它原虫血清则不能，可进行特异性诊断 ［1，8］。抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶染色法（ABPC法)就是其中的一种，Lindsay用兔抗 N.caninum 血清对组织切片进行染色，可检测 到新孢子虫速殖子和缓殖子。而对龚地弓形虫、哈 氏哈芒球虫、枯氏肉孢子虫、杰利氏贝诺孢子虫等不着染，同时兔抗龚地弓形虫血清对 N.caninum 无反应 ［1］ 。
3 血清学诊断
有效的血清学检测对于牛流产的准确诊断、新孢子虫病传播的流行病学调查以及 N.caninum 其它中间和终末宿主的确定是十分必要的。目前，检测牛 N.caninum 抗体的许多种血清学方法已得到报道，包括间接荧光抗体试验（IFAT)、Western blot试验、凝集试验以及ELISA检测方法等。其中IFAT 和ELISA方法应用广泛，且检测结果的特异性和敏 感性都较高［9，10］。
3.1 间接荧光抗体试验（IFAT)
将Vero细胞传代细胞系培养的 N.caninum 固定在载玻片上，用IF-AT测定血清和初乳中抗 N.caninum IgG的抗体效价，血清中IFAT抗体效价为1200～11600，甚至高达16400。另外，也可检查患畜脑脊髓液中的抗体，本法尤其适用于犊牛先天性 N.caninum 感染。本法特异性较强，敏感性较高，检测动物血清抗体时血清稀释100倍后不与龚地弓形虫发生交叉反应［2，9，11］ 。Okeoma，Williamson对269份自然感染N.caninum的牛血清样本进行了不同抗体滴度的IFAT检测，结果表明尽管抗体滴度存在着波动，但IFAT滴度相同的组中 N.caninum 速殖子抗原的染色体条带形式仍然相同，此法可用于识别 N.cani- num 速殖子抗原［12］。
3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA)
现有研究中ELISA检测法主要建立在整体或部分纯化的自然性N.aninum 抗原或重组的 N.canmum 抗原，或 N.can- inum 抗体活性以及 N.caninum特异性竞争抑制性单克隆抗体（MAbs)的基础之上。目前，已研制出了有效的ELISA诊断试剂盒。其中建立在 N.caninum 单克隆抗体（MAb)和表面抗原基础上的ELISA检 测方法的应用广泛，而且诊断的特异性和敏感性都 较高［9，10，13］。
3.2.1 ELISA目前，已研制出了有效的 N.caninum
ELISA诊断试剂盒。Williams［14］等学者对ELISA试剂盒检测牛血清 N.cqninum 抗体的效果进行了估测，并与IFAT的检测结果进行了比较。依试剂盒说明进行检验，检测结果小于20pp的样本为阴性，在20～25pp范围内为可疑，大于25pp的为阳性样本［pp为检测样本的OD值与阳性对照血清（IFAT 效价为15120)平均OD值的百分比］。结果表明，该法与IFAT检测结果有较高一致性，并且更为可 靠，特异，敏感。另外，也可应用ELISA方法检测牛乳中 N.caninum 抗体，Schares G，Barwald A等人应用ELISA检测牛乳中新孢子虫抗体，指出稀释比12的牛乳可得到与相应血清检测呈线性相关的实验结果［15］。临床试验结果表明，Biovet ELISA试剂盒和IDEXX ELISA试剂盒的特异性和敏感性都大于95%，可作为检测牛 N.caninum 抗体的有效方法［14］ 。
3.2.2 MAb-cELISA Baszler等［16］
（1999)人在原有研究基础上，对以单克隆抗体（MAb 4A4-2)为基础的竞争抑制性酶联免疫吸附试验（cELISA)进行了改良。改良后的cELISA方法应用特异性单克隆抗体（5B6-25存在于弗氏完全佐剂中)来俘获自然性N.caninum 抗原，并使之与竞争性单克隆抗体（MAb 4A4-2)直接结合，这两种单克隆抗体可 以结合在不同的抗原表位上而得到保存，它们都主导免疫65-Kda N.caninum 速殖子表面抗原（Nc- 1分离株)。cELISA 方法可以减少非特异性抗体结合，而且允许应用未稀释的待检血清以提高诊断的特异性和敏感性。实验结果中诊断敏感性为97.6%，诊断特异性为98.6% ，表明该法对 N.caninum阳性与阴性样本具有敏锐的识别力。 N.caninum cELISA的特异性取决于MAb 4A4-2，且它可以与抗原直接结合，因此对cELISA的改良以及类似于凝集实验等其它辅助性检验是没有必要的。 cELISA是一种检测牛 N.caninum 抗体的快速，灵敏，准确的方法 ［9，13，17］。
3.2.3 以 N.caninum 表面抗原为基础的ELISA
N.caninum 表面存在许多抗原，N.caninum 主要表面 抗原可作为新孢子虫病的一个重要诊断剂。 NcSAG1是 N.caninum 一个主要表面抗原，Cha-han 等人将编码缺少信号肽和C末端疏水功能区的 NcSAG1（NcSAGlt)的基因克隆，并通过与谷光甘肽-S转移酶（GST)一起作为融合蛋白而使之在大肠杆菌中进行表达。将纯化的GST-NcSAG1t应用到ELISA中以检测牛新孢子虫抗体。该法可对IFAT 检测呈阳性和阴性的牛血清进行明显的区分，而且它不会产生与实验性感染龚地弓形虫小鼠的交叉反 应［18］。Howe和Tang ［19］（2002)对 N.eaninum 主要表面抗原rNcp29进行了研究，并设计了rNcp29r ELISA以检测牛血清中特异性抗体，Ncp29由与龚地弓形虫特异性SAGl基因同源的基因来编码，是 一种重组的表面蛋白，实验结果表明该法可以很快区分 N.caninum 血清反应阳性的牛群（［OD］大于1.2，稀释度为1500或更高)和阴性对照组（［OD］小于0.5，稀释度为1500)。另外，从龚地弓形虫或 枯氏肉孢子虫的动物体分离的血清ELISA检测结 果为阴性，因此rNcp29r ELIhttp://www.med126.com/shouyi/ya/jiage/SA对于检测 N.caninum抗体具有高度的特异性和敏感性。Hye-Jin AHN和Sera KIM等（2003)对另一个 N.caninum 表面抗原Ncp43 （ N.caninum Korean株)进行了研究，其抗原表位位于该分子C末端的23 处（Son et al.，2001)，将纯化的GST与Ncp43 C末端的23处（P片段)进行融合（可应用一个相对较短的缺少特征性标记的6xHis替代GST)，并将其作为抗原设计ELISA试验。结果表明该法能够准确 的检测出特异性 N.caninum 抗体，而且Ncp43与龚地弓形虫的TgSAGlA一起可用于不同哺乳动物的 N.caninum 和龚地弓形虫感染的鉴别诊断 ［20，21］。另外，其它几种重组的 N.caninum 抗原如Nc4.1 和Nc14.1 也可作为重组蛋白进行ELISA试验 以检验特异性 N.caninum 抗体［19］ 。
4 分子生物学诊断
目前，奶牛 N.caninum 病分子生物学诊断方法
中应用较多的主要是多聚酶链式反应（PCR)。此法多以 N.caninum 特异性表面抗原为基础，适用于感 染细胞培养基中的病原和福尔马林固定、石蜡包埋 的组织中 N.caninum 病原的检测。
4.1 Indirectly in situ PCR
此法是Loschen-ber- ger等（2004)研究的检测 N.caninum 的一种新方法，它具有高度的特异性和敏感性，能替代免疫组化方法，可通过半抗原标记的核苷PRINS反应检测到，也可通过荧光染色体标记的抗体显示出来［22］。
4.2 检测Nc-5基因的PCR
Paula等（2004)从12头2岁的妊娠5个月流产牛胎的临床样本中采集血液并分离DNA，应用Np21+和Np6+引物对对N.caninum NC-5基因的350bp片段进行PCR扩增，同时应用Tim3和Tim11引物对对内转录阻断物1 （ITSI)进行扩增。证明此法效果很好［23］。Fernandez和Mora（2002)设计了一个二次PCR 法以定量检测牛流产胎儿中的 N.caninum ，他们设计寡聚核苷酸引物以扩增 N.caninum Nc-5序列的76bp DNA片段的相应基因。结果表明这种PCR方法可用于新孢子虫病的定量检测［24］。另外，Müller 和Vonlaufen（2002)设计了二次荧光PCR试验以定量检测鼠中枢神经系统组织切片中的新孢子虫，这 种应用双重荧光杂交技术的PCR可有效的检测脑组织中的新孢子虫［25］ 。
4.3 单管套式PCR（single tube nested PCR)
El-lis，McMillan等［26］（1999)描述了一种检测新孢子虫的具有两个连续步骤的单管套式PCR技术（single tube nested PCR)这种PCR诊断法对于靶序列的特异性复制产物特别敏感，可从分离于自然感染的牛及犬的福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本中扩增 N.caninum DNA，达到临床诊断的目的。并对PCR MIMIC也做了描述，有待于更深入的研究以证实此 项技术对于研究 N.caninum 生物学特性中的作用。
5 结语
综上所述，奶牛 N.caninum 病的诊断要结合临床症状、流行病学、病理组织学变化的特点，应用多 种检测方法进行综合诊断。血清学检测和PCR检 测是诊断奶牛 N.caninum 病的有效方法。特异性PCR检测以及建立在 N.caninum 特异性表面抗原和竞争抑制性单克隆抗体基础上的ELISA方法，诊断的特异性和敏感性都很高，适用于感染细胞培养基中的病原和福尔马林固定、石蜡包埋的组织中 N. caninum 病原的检测。在实际工作中，我们要根据实际情况，选用相应的方法诊断奶牛的新孢子虫病。
