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动物生化学重要技术(电泳技术)

来源:本站原创 更新:2011-11-24 执业兽医考试论坛

二 醋酸纤维薄膜电泳
醋酸纤维薄膜(CAM)是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。根据其乙酰化程度、厚度、孔径和网状结构等方面不同而具有不同类型。现已广泛应用于各种生物分子的分离分析中,如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简单快速等优点:①电泳区带界限清晰;②通电时间较短(20min至1h);③对各种蛋白质基本无吸附,因此无拖尾现象;④不吸附染料,因此薄膜上未与蛋白质结合的染料可完全洗掉,显示电泳区带背景干净。电泳须在密闭容器中使用较低电流进行,因薄膜吸水量较低,可避免过分蒸发。其电渗作用虽高但很均一,不影响样品分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低,由于薄膜厚度小(约10~100μm),样品用量很少,不适于制备。
影响电泳的因素:①膜的性质;②缓冲溶液的组成,pH值和浓度;③电流和有效电压;④电泳时间和温度;⑤电泳槽的密封性能。
操作步骤:点样→电泳→染色→漂洗→透明→测定吸光度。
选用一定长度和宽度的薄膜条,在其一端处点上样品,在一定电压、电泳条件下,进行电泳。染色可根据不同物质使用不同的显色方法,如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位。染色漂洗后,可将电泳区带剪下,溶于一定溶液中进行吸光度测定,也可浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明,然后直接用吸光度计测定。
?电泳结果不满意或失败的可能原因有:①醋酸纤维素薄膜过分干燥出现白斑、膜弯曲、表面缓冲液过多;②缓冲溶液浓度过高或使用次数太多,时间过长而改变浓度;③样品量太多、加样不整齐、起始位置错误;④电泳时间过长或过短、电泳槽密闭性不好、电流太大、温度过高;⑤染色液连续使用次数过多,pH值改变。

三 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提取出来的,是由D-半乳糖和3、6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖,含硫酸根比琼脂少,因而分离效果明显提高。
琼脂糖电泳具有以下优点:①琼脂糖含液体量大,可达98%~99%,近似自由电泳,但样品的扩散度比自由电泳小,对蛋白质的吸附极微;②琼脂糖作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高重复性好等优点;③电泳速度快;④透明而不吸收紫外线,可以直接用紫外检测仪作定量测定;⑤区带可染色,样品易回收,有利于制备。缺点是琼脂糖中有较多硫酸根,电渗作用大。
缓冲液的选用:琼脂糖电泳常用缓冲液的pH在6~9之间,离子强度为0.02~0.05。离子强度过高时,会有大量电流通过凝胶而产生热量,使凝胶水分蒸发,析出盐结晶。严重可使凝胶断裂,电流中断。常用缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度改变,可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液混匀后再使用。
琼脂糖电泳常用于抗原抗体反应的分析,抗体的分离。其种类较多,如高压琼脂糖免疫电泳,定量免疫电泳(火箭免疫电泳,双向免疫电泳)等。

四 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳,这种凝胶由丙烯酰胺,简称Acr和交联剂N,N′-甲叉基(亚甲基)双丙烯酰胺,简称Bis聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好,弹性大,透明,化学稳定性高,无电渗作用,设备简单,用样量少(1-100μg)和分辨率高等优点。并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶,可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。
还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS),以测定蛋白质亚基分子量。
根据凝胶形状可分为盘状电泳和板状电泳。盘状电泳是在直立的玻璃管内,利用不连续的缓冲液的pH值进行电泳,同时,由于样品混合物被分开后形成的区带非常窄,呈圆盘状,故而得名。板状电泳(垂直或水平)是将丙烯酰胺聚合成方形或长方形平板状,平板大小和厚度视实验需要而定。垂直平板电泳有如下优点:①表面积大,易于冷却,便于控制温度;②能在同一凝胶板上,相同操作条件下,同时点加多个样品,便于相互比较;③一个样品在第一次电泳后,可将平板转90度进行第二次电泳即双向电泳;④便于用各种方法鉴定(如放射自显影等)。其缺点是制备凝胶时操作较复杂,电压较高,电泳时间较长。


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