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四 分光光度法的误差
在分光光度法中，即使将各种因素都控制好，对于浓度过大或过小的样品，误差仍然很大。因为浓度过大的样品，其吸光度过高，影响检测器的灵敏度，且读数标尺刻度的精度差，误差亦大。浓度过低的样品，其吸光度小，则因与仪器本身因素有关，也容易引起检测器标尺上的读数误差。例如光源波动的影响：当光源强度改变１％、吸光度为1.0时，只有0.4%的误差，但在吸光度为0.045时，则可产生9.6%的误差。实际上，在整个透光度（或吸光度)范围的不同部分均有不同的误差。从理论上推算，相对误差最小的部分在透光度为３36.8%处（或吸光度为0.4343处)，故通常认为测定值在吸光度0.20～0.80范围内（透光度为20%～65%)误差较小，超出此范围，相对误差均会增大。
影响分光光度法精确度的主要原因还有光谱纯度。分光光度计应能正确选出光源光谱中所需部分波长作为入射光，一般应保持光谱带宽度在10nm以下，如果测定样品有很狭窄的吸收峰，就必须有更小的光谱宽度，所以分光光度计大多均有可调的狭缝。
散射光也是引起误差的重要因素。这里所说的散射光是指一切未经过测定溶液吸收，而又落到检测器上引起干扰的光，如室内自然光，经过某些漏洞进入仪器而明显增大了透光度，故高灵敏度的分光光度计宜安装光线较暗的室内。散射光也包括能透过比色皿的非测定需要的其他波长的光，实际上是光谱不纯，但因效果与散射光一样，故也称为散射光干扰。散射光干扰对高浓度测定特别有害，能使吸光度降低，标准曲线的高浓度部分向下弯曲。
五 常见国产分光光度计的使用
(一)721型分光光度计
这是一种采用光电管为受光器的较高级可见光分光光度计，其波长范围为360～800nm，在410～710nm之间的灵敏度较好。
使用方法如下：
１．灵敏度选择钮放在“１”档（如调不到“０”时选用较高的档)。
２．转动波长选择钮，选用所需的波长。
３．接通电源（指示灯亮)。
４．揭开比色杯暗箱盖，转动“０”电位钮使电表指针对准Ｔ＝０处。
５．将比色杯放入比色杯架，使空白管对向光路，盖好比色杯暗箱盖。转动“100”电位钮，调准电表指针使之指向Ａ＝０（Ｔ＝100)处。
６．拉动比色杯架的拉杆，使测定杯依次进入光路，迅速从电表上读取吸光度值，记录。
７．比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。
(二)722型分光光度计
本仪器是可见光分光光度计，
其波长范围为360～800nm，具有测量被测溶液透光率（Ｔ)值，吸光度（Ａ)值，浓度直读，模拟信号输出等功能。
使用方法如下：
１．仪器预热 仪器开机后灯及电子部件需预热平衡，故应预热30min，此时样品室盖应打开。
２．调节波长 用波长调节钮调至所需波长处。
３．调置满度、调零 将空白溶液的比色杯放在试样槽架第一格，其余格放待测溶液的比色杯，此时空白溶液对准光路。盖上样品室盖，按MODE键，使TRNAS指示灯亮，然后按100%Ｔ键，示窗能自动调整透射比为100.0（一次有误时可加按一次)。
４．打开样品室盖， 示窗能自动调整透射比为0.000，连续重复２～３次即可。
5. 按MODE键，使ABS指示灯亮，此时空白液对应的吸光度应为0.000。拉动拉杆，当拉杆到位时有定位感，即可在显示窗上分别读取各自的吸光度值。
6．测定完毕后，先打开样品室盖，再断电源。比色杯应清洗干净后，再贮放保存。
7．浓度直读 按MODE键，使CONC指示灯亮，将已标定浓度的溶液移入光路，按下浓度调节键（↑100%Ｔ键和0%Ｔ键↓)，使数字显示为标定值，将被测溶液移入光路，即可读出相应浓度值。
(三)使用分光光度计时的注意事项
１．分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。
２．比色杯盛液量以达到杯容积２／３左右为宜。若不慎将溶液流到比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。
３．不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。
４．用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。若用上法洗不净时，可用５％的中性皂溶液或洗衣粉稀释浸泡，也可用新配制的重铬酸钾－硫酸洗液短时间浸泡，之后立即用水冲洗干净。洗涤后应把比色杯倒置凉干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。
５．一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.1～0.7的范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。
６．仪器连续使用时间不应超过2h，每次使用后需要间歇半小时以上才能再用。
７．每套分光光度计上的比色杯及比色杯槽不得随意更换。
８．分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。
