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三 提取和纯化
提取是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中，让被提取的生物大分子充分释放出来的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守“相似相溶”的原则。扩散作用对生物大分子的提取有一定的影响。减小溶剂的粘度、搅拌和延长提取时间可提高其扩散速度，增加提取效果，提取的原则是“少量多次”，即对于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取效果好得多。
（一)蛋白质（包括酶)的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
1、水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1～5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度一般采用低温（５℃以下)操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸、碘乙酸等)。
下面着重讨论提取液的pH和盐浓度的选择：
（１)pH 蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。
（２)盐浓度 稀盐溶液可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用医学.全在.,线提,供www.med126.com。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCL等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02～0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。
2、有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，可用乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂提取。它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的提取脂蛋白的提取液，但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
（二)蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有以下几类。
1、根据蛋白质溶解度不同的分离方法
(１)蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象叫盐析。将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子如硫酸铵有很强的水化作用，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液ｐＨ在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是溶解度的温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶液为4.1mol/L，即541.2ｇ/Ｌ；０℃时溶解度为3.9mol/L(514.8ｇ/Ｌ)，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的ｐＨ常在4.5～5.5之间，当用其他ｐＨ进行盐析时，需要硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸)，用缓冲液进行透析，并不断地更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡聚糖凝胶Ｇ—２５或Ｇ－５０过柱的办法除盐，所用的时间比较短。
(２)等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的ｐＨ达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。
(３)低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出。此法分离效率比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
2、根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
（１)透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分子分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同相对分子质量的蛋白质。
（２)凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶（详见层析技术)。
3、根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同ｐＨ环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
（１)电泳法 各种蛋白质在同一ｐＨ条件下，因相对分子质量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开（详见电泳技术)。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的ｐＨ梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的ｐＨ位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
（２)离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素)和阴离子交换剂（二乙基氨基乙基纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变ｐＨ或离子强度的办法将吸附的蛋白质洗脱下来（详见层析技术)。
4、根据配体特异性的分离方法———亲和层析法
亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它通常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。例如，酶－辅酶，抗原－抗体，激素－受体等。（亲和层析的基本原理详见层析技术)
蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、提纯和鉴定是生物化学中的重要部分，至今还没有一个单独或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
（三)核酸的提取
核酸都溶于水，而不溶于有机溶剂，利用此性质进行提取。在细胞内DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（DNP)，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（RNP)，在不同浓度的盐溶液中它们的溶解度差别很大，DNP在纯水或1 mol/LNaCl溶液中溶解度较大，但在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度很低，相反，RNP易溶解。因此，用0.14mol/LNaCl溶液可简单地初步分开DNP和RNP。
在分离核酸中最困难的是将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。常用的解离剂是阴离子去垢剂，如脱氧胆酸钠，十二烷基硫酸钠（SDS)，４－氨基水杨酸钠和萘－1，5－二磺酸钠等，它们具有溶解病毒、细菌的作用，可使核酸从蛋白质上游离出来，还具有抑制核糖核酸酶的作用。另外除去核酸中的蛋白质的一个有效办法是用酚－氯仿混合液，它们可使蛋白质变性，并对核糖核酸酶有抑制作用，另外氯仿比重大可使有机相和水相完全分开，减少残留在水相中的酚。在用酚－氯仿抽提核酸提取液时，还须要剧烈振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，在酚－氯仿抽提液中再加上一定量的异戊醇。
（四)核酸的纯化
核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质，通常只要用酚／氯仿、氯仿抽提核酸的水溶液即可。每当需要把DNA克隆操作的某一步所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如果从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶Ｋ等，它们对多数天然蛋白质均有活性。
用酚／氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。具体步骤如下：
①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚／氯仿；②旋涡混匀管内容物，使呈乳状；③12000ｇ室温离心15ｓ；④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相；⑤重复步骤①～④，直至两相界面上无蛋白质为止；⑥加入等体积的氯仿并重复②～④步操作；⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。
(五)核酸的浓缩
应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成的核酸沉淀可经离心而回收。甚至对低至ｐｇ（皮克)量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。具体操作时，可向含样品的小离心管中加入单价阳离子盐贮存液。单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂在70％乙醇中仍保持可溶。
DNA和RNA的沉淀，大多使用醋酸钠（pＨ5.2)。
