| 公开(公告)号 | CN1116416C |
| 公开(公告)日 | 2003.07.30 |
| 申请(专利)号 | CN00124700.X |
| 申请日期 | 2000.09.29 |
| 专利名称 | 运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素a1的方法 |
| 主分类号 | C12N15/63 |
| 分类号 | C12N15/63;C12N15/31;C12N1/13;A61K38/16 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 厦门大学 |
| 发明(设计)人 | 章军;楼士林;徐虹;罗田 |
| 地址 | 361005福建省厦门市思明南路422号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 厦门南强之路专利事务所 |
| 代理人 | 陈永秀;马应森 |
| 国省代码 | 福建;35 |
| 主权项 | 运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素α1的方法，其特征在于按设计从蓝藻Calothrix 7601染色体DNA上PCR扩增出藻蓝蛋白cpc2启动区、整合平台同源片段L和R，组装了含cpc2启动子、UBTα1目的基因、rbcS终止子、Kmr报告基因和基因平台同源序列元件的供体质粒pUTK，建立了Calothrix 7601新的基因整合平台系统，获得了转UBTα1基因的藻株，其具体方法步骤如下：(1)cpc2启动区P以及同源DNA片段L和R的克隆同源片段L和R分别选择在cpc2操纵子的cpcB2、A2基因当中。根据丝状蓝藻Calothrix7601的cpc2操纵子的启动区P以及同源片段L和R这三个片段两端的核苷酸序列分别设计三对PCR引物P1和P2，L1和L2，R1和R2，其序列如下：P1(5’端引物)：5’-GCGTCGACGAATTGTAAGAA-3’SalIP2(3’端引物)：5’-ATGCATGCTCCAGCATCTCCTA-3’SphIL1(5’端引物)：5’-CGGAATTCTGCTATTAGTCCGC-3’EcoRIL2(3’端引物)：5’-CGGTCGACGCCCTCGGTTAAAGGTGT-3’SalIR1(5’端)：5’-CGGTCGACTGTAGCTCCTTAATGTC-3’SalIR2(3’端)：5’-CCTAAGCTTTCTTGATATTCGGCTG-3’HindIII其中启动区左端引物P2设计了一个SphI酶切位点，其序列为GCATG↓C，以Calothrix7601的染色体DNA为模板，按常规的PCR技术分别扩增出0.6kb片段P，1.2kb片段L和1.2kb片段R；根据引物中的酶切位点，用SphI和SalI同时双酶切片段P和载体pUC19，然后用T4 DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pUCP；用HindIII和SalI同时双酶切片段R和载体pUC19，然后用T4 DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pUCR；用EcoRI和SalI双酶切片段L和重组质粒pUCP后，用T4 DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pULP；(2)外源供体片段DNA的克隆：a.卡那霉素-Kmr报告基因和rbcS polyA终止区的克隆：选择含有报告基因卡那霉素-Kmr和终止区rbcS polyA两个片段的质粒pKYLX71，用XbaI和SalI双酶切pKYLX71，胶回收4.8Kb的DNA片段，与经同样双酶切的重组质粒pUCR连接，连接物转化E.coli JM101，以含有Ap和Km的双抗培养基筛选，获得了8.7kb的重组质粒pUKR；b.目的基因UBTα1的获得及克隆：按Tα1基因的序列设计了以下PCR引物T1、T2和T2’：T1(5’端片段)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTGTTSphI BamHIGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’(65Nts)T2(3’端片段)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCAACSpeIAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3 (65Nts)T2’(3’端引物)：为T2之5’端的前25个核苷酸以T1和T2为引物，按常规PCR扩增得Tα1片段，以质粒pUCUB为模板，引物为U1和U2，PCR扩增出UB片段，用BamHI酶切Tα1和UB片段后连接，再以此连接物为模板，以U1和T2’为引物扩增获得UBTα1片段。用XbaI和HindIII不完全酶切pUKR，回收6.0Kb片段，用SphI和SpeI双酶切目的基因UBTα1；用SphI和HindIII双酶切pULP；将以上三种酶切片段混合后连接，转化，以Ap和Km双抗筛选，获得了供体质粒pUTK；(3)供体质粒pUTK电激转化Calothrix 7601用EcoRI完全酶切pUTK，获得线状质粒pUTK，在电压0.4～2.0kv，电阻100～200Ω，时间2.5～5.0ms、电容25μF的条件下电激转化蓝藻Calothrix 7601，将经电激处理后的转化藻株经培养，以Km筛选，获得转UBTα1基因的藻株。 |
| 摘要 | 涉及一种基因工程，从蓝藻Calothrix 7601染色体DNA上PCR扩增出cpc2启动区、整合平台同源片段L和R，组装了含cpc2启动区、UBTα1目的基因、rbcS终止子、Kmr报告基因和基因整合平台同源序列等元件的供体质粒pUTK，建立了Calothrix 7601新的基因整合平台系统，获得转UBTα1基因的藻株，并从中检测到Tα1基因的表达产物。本发明以蓝藻作为新型基因工程受体和生物反应器，使人的Tα1基因在其中高效表达，以大量生产Tα1，具有很大的开发前景。 |
| 国际公布 |
