重组人aFGF在家蚕体内基因工程表达生产的方法

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公开(公告)号	CN1276081C
公开(公告)日	2006.09.20
申请(专利)号	CN200510048965.9
申请日期	2005.01.13
专利名称	重组人aFGF在家蚕体内基因工程表达生产的方法
主分类号	C12N15/09(2006.01)I
分类号	C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/866(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I
分案原申请号
优先权
申请(专利权)人	浙江大学
发明(设计)人	吴小锋;曹翠平;姚慧鹏
地址	310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号
颁证日
国际申请
进入国家日期
专利代理机构	杭州求是专利事务所有限公司
代理人	林怀禹
国省代码	浙江;33
主权项	重组人aFGF在家蚕体内基因工程表达生产的方法，其特征在于：(1)人aFGF基因的克隆：以人脑cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人aFGF基因，引物设计如下：正向引物：5′-AGATCTTTTAATCTGCCTCC-3′，含有BglII酶切位点；反向引物：5′-AGATCTTTAATCAGAAGAGAC-3′，含有BglII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后1个循环，72℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆入3.9kb载体pCR2.1，获得pCR2.1-aFGF，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆人aFGF基因顺序正确性；(2)含有人aFGF基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BglII消化pCR2.1-aFGF得到人aFGF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pAcGP67b获得重组体pAcGP67b-aFGF；通过共转染在昆虫细胞内与杂交杆状病毒HyNPVDNA同源重组产生重组病毒，共转染的方法为：1μgpAcGP67b-aFGFDNA和15μgHyNPVDNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf21培养细胞；先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，将此重组病毒命名为HyNPV-aFGF；(3)家蚕体内表达和重组人aFGF纯化：使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前将幼虫浸在冰水浴中进行短时间麻醉，然后采用皮下注射的方法注射重组病毒悬浮液，浓度为106pfu/ml，每条家蚕注射20μl，注射1小时后喂桑，并在23-25℃下饲养；感染后72-96小时内收集家蚕幼虫，解剖感染家蚕的脂肪体，并用此作为纯化重组人aFGF的起始材料；将脂肪体匀浆后溶解在预冷的pH7.6，20mMTris-HCl缓冲液中，经高速离心后将上清液直接上肝素Heparin亲和层析柱，由于人aFGF与肝素具有强烈的亲和性而使人aFGF结合到层析柱上，然后用含有0.4MNaCl的上述同样缓冲液洗脱去掉杂蛋白，最后用2.0MNaCl的缓冲液一步洗脱出结合的人aFGF，通过SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白，结果显示获得的重组人aFGF纯度很高；(4)重组人aFGF活性分析鉴定：用人脐静脉内皮细胞HUVEC分析重人aFGF的生物活性：人脐静脉内皮细胞HUVEC在培养基199中37℃培养，补充5％的CO2，培养基中另外添加100units/ml青霉素、100units/ml链霉素、4.0mg/ml两性霉素B、20％热灭活补加牛血清、5units/ml肝素和50mg/ml内皮细胞生长补充物质ECGS；上述细胞用胰蛋白酶消化后接种于24孔组织培养板，细胞密度大约为1.0×104cells/well，每孔加1ml同样的培养基；24小时后，将培养基更换为含有10％SCS和5units/ml肝素、但是不含有ECGS的新鲜培养基199；纯化的重组人aFGF经梯度稀释后用0.22μm灭菌过滤器过滤灭菌，加入到上述培养板孔中，每孔体积不超过10μl；72小时后，用PBS洗两次，用胰蛋白酶消化后离心收集上述细胞，重悬于200μlPBS中；0.4％台酚蓝染色后，用血球计计算细胞个数；结果表明，重组人aFGF能够刺激上述细胞的分裂、增殖，表明家蚕幼虫中表达的重组人aFGF具有生物学活性。
摘要	本发明公开了一种重组人酸性成纤维细胞生长因子人aFGF在家蚕体内基因工程表达生产的的方法。利用申请人构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体，构建了含有人aFGF基因的重组病毒。利用家蚕作为重组病毒的宿主，表达了具有生物活性的重组人aFGF。解决了人aFGF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点。利用亲和层析从脂肪体中纯化人aFGF，从每头家蚕获得的产量为600-700μg。活性分析表明，重组人aFGF具有促进细胞分裂增殖的生物活性。利用基因工程技术用家蚕作为表达载体可以大量生产重组人aFGF，为它在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。
国际公布

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