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1.2.1DNA的提取 改良Miller盐析法[2]提取的DNA溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。
1.2.2聚合酶链式反应连接酶检测反应(PCRLDR)分析采用Primer 3.0软件设计特异性引物,见表1。表1hCHK2基因3个SNP位点的上、下游引物序列hCHK2基因SNP位点上游引物(5′3′)下游引物(5′3′)产物长度
PCR反应体系：总体积20 μl，含模板DNA 1 μl，1×Buffer缓冲液2 μl，Mg2+0.6 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl，1×QSolution 4 μl，Primer引物0.4 μl，浓度0.2 pM，加水补足。反应条件：95℃预变性15 min;94℃30 s，57℃退火1 min，72℃延伸7 min，35个循环。根据LDR探针设计原则[3]设计LDR的荧光探针，对该基因待检测的SNP位点，在位点的5’方向根据SNP的碱基类型设计两条特异性探针，每条探针的3’末端碱基分别与此位点的一种等位基因型相对应，此外在该位点的3’方向序列中设计一条末端带有FAM修饰的通用探针(蓝色荧光)，见表2。表2hCHK2基因3个SNP位点LDR连接反应探针序列探针名称探针序列(5′3′)产物长度反应条件：95℃2 min，94℃30 s，60℃2 min，进行35个循环。
1.2.3基因分型取LDR产物、内参比荧光ROX和测序胶上样缓冲液(loading buffer)各1 μl等体积混合，应用377型DNA测序仪(ABI，美国)检测结果。以ROX为内参分子量标准，检测不同长度DNA片段的荧光强度，并根据产物片断大小确定基因型。
1.3统计学处理全部统计分析在SPSS15.0软件上进行。HardyWeinberg吻合度检验及两组间基因多态性位点的基因型和基因频率比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。
2结果
2.1PCR实验结果PCR反应产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。
2.2hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077位点基因分型结果应用ABI公司Model自动测序仪进行序列分析，确定hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077位点基因型，结果见图2医.学.全.在.线www.med126.com。
2.3遗传平衡检验经HardyWeinberg遗传平衡检验得出hCHK2基因rs2602431、rs2278022、rs2970077位点所对应的P值均>0.05，符合HardyWeinberg遗传平衡定律[4]，表明研究对象的选择无遗传学偏差，该群体是遗传平衡群体，具有一定的人群代表性。
2.4hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3个位点等位基因和基因型与食管癌易感性的关系hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3个SNP位点基因型在病例组和对照组中的频率分布经χ2检验后，不同位点基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表3。
3讨论
食管癌(Esophageal Cancer，EC)是全世界最常见的十大恶性肿瘤之一，全世界每年新发病例可达48万人[5]，是发展中国家最常见的一种消化道恶性肿瘤，是危害我国居民健康的主要恶性肿瘤之一[6]。食管癌的发生和发展是一个多因素、多阶段的综合过程，其发病机制目前尚未明确。由于DNA损伤是细胞癌变的前提，为确保DNA损伤后遗传物质的完整性和正确性，机体细胞的DNA修复系统和细胞周期调控系统发挥了重大作用，因此对细胞调控基因hCHK2(细胞周期检测点激酶2)基因的多态性进行了检测。细胞周期检测点激酶2 (checkpoint kinase 2, CHK2)基因位于染色体22q12.1，包含14个外显子，其cDNA全长为1 731 bp。细胞周期检测点在细胞周期调控中起重要作用，可以检测细胞外界或内部的各种异常，从而抑制细胞周期的进程，同时修复损伤或使不能修复的细胞进入凋亡。检测点作为保护机制可确保遗传的稳定性。一旦检测点发生缺陷，带有损伤的细胞可能会异常扩增，使肿瘤发生的风险大大增加。对于hCHK2基因，Zheng等[7]的研究表明，第84密码子A252G多态性与患头颈部鳞状细胞癌的风险性也有关;Jonine等[8]的研究表明，CHEK2
