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组胺不仅在细胞及组织内发挥各种生理作用，而且可引起变应性鼻炎.组胺的各种作用是通过与细胞表面的组胺受体结合实现的，到目前为止所了解的组胺受体共有4种，分别为1,2,3,4型［12］.不同亚型的组胺受体起着不同的G联结蛋白质受体的功能,其中人1型组胺受体基因位于3p25染色体上，在胎盘中可见较多的表达，在肺、骨骼肌、心脏及脑组织中可见少量的表达［34］.2型组胺受体基因位于13号染色体上，在胃中有较强的表达，亦表达于脑组织及心脏［5］.胃壁细胞2型组胺受体被刺激时，可促进胃酸的分泌.3型组胺受体位于20号染色体上，可在丘脑的各个部位内选择性地表达［6］，并表达于中枢神经系统及末梢神经系统，对神经起调节作用［7］.4型组胺受体基因位于18q11染色体上，多表达于骨髓及脾脏，亦表达于末梢血液、胸腺、小肠及结肠［89］.目前认为4型组胺受体可能是Gi结合型受体，对免疫功能的影响及作用机制尚不十分清楚.成纤维细胞在人体中维持组织的结构，分泌各种化学趋化因子如IL8，CMCSF，eotaxin，IL1,IL6等［1014］.上述现象提示，鼻息肉组织成纤维细胞中可能存在组胺受体，而其在鼻息肉的生成及发育过程中可能起着重要的作用.本研究旨在探讨鼻息肉组织成纤维细胞中组胺受体及其亚型的存在与否，观察鼻息肉组织中组胺受体蛋白的表达程度.
1 对象及方法
1.1 对象 选择鼻息肉患者5例为研究对象，并将同侧的下鼻甲黏膜为对照组.所有患者均有鼻涕及鼻塞等鼻部症状，MAST检查呈阴性，AST及NPT检查亦呈阴性，排除合并变应性鼻炎；所有患者均无吸烟史及其他疾病.术前2周内禁用激素、抗生素及抗组胺类药物.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 行功能性鼻内窥镜手术，切除鼻息肉及部分下鼻甲黏膜，行组织细胞培养.成纤维细胞培养：用含有500U/mL青霉素,500mg/L链霉素,6mg/L fungizon(GIBCO,美国)的PBS洗涤3次，将下鼻甲黏膜切成1mm3大小，置于培养皿内，室温下放置5min，使之黏附，再添加含有100g/L FBS的Dulbeco’s Modified Eagle’s medium(DMEM, GIBCO,美国)培养液进行培养，当形成单层成纤维细胞后除去培养液，用PBS洗涤，添加0.5g/L胰蛋白酶EDTA，置于37℃，50mL/L二氧化碳培养箱内处理5min，使细胞分离，用含有20g/L FBS及抗生素的DMEM培养液浮游细胞，进行隔代培养（图1).将培养的成纤维细胞分别灌注到6孔培养皿中，每孔细胞数为3×105个，本实验中应用的是2代培养的纤维母细胞.
图1 培养完成后的鼻黏膜成纤维细胞
1.2.2 RTPCR RNA的分离依照RNABee溶液的分离方法(Teltest,Inc,Friendswood,美国)进行.在直径为60mm培养皿里放入1mmol/L RNABee溶液进行溶解，添加0.2倍的氯仿使之混合后置于冰块上，5min后用离心机（Centrifuge 5402,Eppendrof,德国)于12000r/min，4℃离心15min，取上清液，加入同等量的isopropanol，在室温条件下沉淀10min，随后以12000r/min，4℃离心5min，弃去上清液，向沉淀物中加入750mL/L乙醇0.8mL，以7500r/min，4℃离心5min，置于空气内10min，使沉淀物在空气中干燥后分离出ＲＮＡ，将其用ＤＥＰＣ处理过的蒸馏水溶解.采用荧光分光光度计(Ultraspec 2000,Parmacia Biotech,Cambridge,英国)于波长为260nm及280nm处测定ＲＮＡ值，Ａ２６０／Ａ２８０比值为１.５～１.８，将ＲＮＡ置于-70℃保存.为进行酵素聚合连锁反应需合成相补的ＤＮＡ（cDNA).将１μg ＲＮＡ调节到用ＤＥＰＣ处理过的蒸馏水１０μL中，７０℃加热５min，于冰块上放置5min.加入２μL的１０×缓冲剂(0.1mol/L Tris盐酸, pH值为9.0,0.5mol/L氯化钾,10g/L Trition X100),取4μL 25mmol/L氯化镁， 2μL 10mmol/L dNTP,0.5μL(40U/μL)RNase抑制物,加入15U ＡＭＶ反向transcriptase(Promega,Medison,WI,美国)后将总剂量调整至２０μL.反应条件为４２℃ １h，９５℃ ５min，４℃ ５min.PCR反应如下:在２μL cDAN中加入５μL的１０×ＰＣＲ buffer(100mmol/L Tris盐酸, pH值为8.3, 0.5mol/L氯化钾,15mmol/L氯化镁),4μL的2.5mmol/L dNTP,20pmol上游及下游引物，２U Ｔaq DNA聚合酶(TAKARA,日本)，灭菌蒸馏水调整至50μL.利用遗传因子增幅器（Biometra, Gottingen,德国)进行扩增，具体的条件为组胺受体（HR1，HR2，HR3，HR4与βactin)初期变性95℃ 5min，95℃ 1min,55℃ 1min，72℃延长1min，共30个周期（βactin是25周期)，最后的延长是72℃10min.10μL PCR生成物内混合加入2μL的6×载入缓冲液(2.5g/L溴酚蓝,2.5g/L二甲苯蓝,300g/L蔗糖)，再添加0.5mg/L溴化乙锭，于含0.5×TBE(45mmol/L Trisborate, 1mmol/L EDTA)的20g/L琼脂糖凝胶中，以90V电压下电泳1h，利用Gel Doc 1000凝胶成象系统（BioRad, Hercules,CA,美国)观察条带.1型及2型组胺受体的阳性对照选择鼻黏膜的上皮细胞，3型及4型的选择人末梢血液白细胞.Realtime PCR：向1.5mL实验管内加入25mmol/L氯化镁2.4μL,2μL含Lightcycler fast start enzyme的DNA master SYBR green Ⅰ, 10pmol上游及下游引物，以蒸馏水调节为１８μL，向１８μL混合物中加入２μL cDNA后，分别灌注到离心管内，于７００r/min条件下离心５min，移至Lightcycler增幅器（Roche Applied Science, Mannheim,美国).１型及２型组胺受体βactin的退火温度为５５℃，根据ＰＣＲ生成物的大小将速度调节为２５bp/s进行实时扩增医.学.全.在.线www.med126.com.
1.2.3 流式细胞仪检测 用ＰＢＳ将已形成单层的成纤维细胞洗涤2次，37℃条件下用0.5g/L胰蛋白酶EDTA处理5min，向细胞内添加100g/L FBS，收集细胞，以12000r/min，４℃离心５min，用冷PBS洗涤细胞沉淀物２次，添加１型及２型组胺受体的1次抗体（Chemicon,Temecula,CA,美国)稀释２０倍，在４℃条件下反应１h，待反应结束后用冷PBS洗涤２次，用异硫氰酸荧光素结合抗体(Chemicon, Temecula,CA,美国)稀释5000倍后，于４℃条件下反应1h，用冷PBS洗涤２次，利用ＦＡＣＳ进行测定.在无刺激条件下培养２４h，测定１型及２型组胺受体蛋白.
