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1.3 实验分组及处理
将细胞随机分成三组(n=8)：对照组、高糖组和辛伐他汀组。细胞同步化处理后，对照组加正常培养液，高糖和辛伐他汀组在培养液中加入葡萄糖，终浓度为30 mmol/L, 辛伐他汀组同时加入终浓度为1 μmol/L辛伐他汀。分别于高糖处理6,12,24,48,72 h时检测α-SMA表达情况。
1.4 免疫细胞化学检测α-SMA的表达情况用4%多聚甲醛在4 ℃下固定细胞10 min后用3%H2O2处理10 min，用10%羊血清封闭10 min，加一抗4 ℃下孵育12 h。加二抗室温孵育2 h,DAB显色。在显微镜下，随机取5个视野，计数每个视野中的阳性细胞百分比 (阳性细胞百分比=该视野阳性细胞数/该视野总细胞数×100%) ，取平均值做为该孔的阳性细胞百分比。
1.5 Western blot测定α-SMA的表达按照蛋白质抽提试剂盒说明进行蛋白提取。用BCA蛋白定量法测定蛋白质浓度。10%SDS-PAGE电泳，低压半干转膜3 h后进行免疫反应，加入α-SMA一抗4 ℃下孵育12 h。加二抗室温下孵育2 h后，DAB显色10 min后采像。用图象分析软件Image Pro Plus 6.0对目标条带积分光密度值(IOD)进行测定，以目标条带的IOD比内参的IOD值做为α-SMA的相对表达量。
1.6 统计学处理
计量资料结果用均数±标准差表示(x±s),采用单因素方差分析。用SPSS 13.0统计学软件进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫细胞化学检测α-SMA表达α-SMA阳性表达为胞浆中出现黄褐色呈纺垂形或放射状分布丝状物(图1~6)。对照组各时间段内均无阳性细胞，高糖组和辛伐他汀组均在6 h出现阳性表达，48小时达高峰， 并持续至实验结束。与高糖组比较，辛伐他汀组各时间点阳性细胞均明显减少(见表1)。
2.2 Western blot检测α-SMA结果对照组各时间段内均表达量极低，高糖组从6 h出现表达， 并持续增高至实验结束。与高糖组比较，辛伐他汀组各时间点α-SMA表达均减少(见表2)。
表1 各组不同时间点α-SMA表达阳性细胞百分比比较(略)
与对照组比较，^P<0.05;与高糖组比较，#P<0.05
表2 各组不同时间点Western blot检测的α-SMA 表达结果比较(略)
与对照组比较，^P<0.05;与高糖组比较，#P<0.05
3 讨论
转分化是指细胞在病理情况下失去其特有的表型，获得新的表型，转化为另一种细胞的过程。正常情况下肾小管上皮细胞不表达α-SMA，但在病理状态下各种损伤刺激均可启动肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT)，肾小管上皮细胞可转化为Myof，并表达间质细胞的标志蛋白—α-SMA。因此实验研究中以α-SMA作为肾小管上皮细胞转分化的标志，只要细胞中发现α-SMA，无论其表达量的多少，均可认为细胞发生了转分化[12]。此时细胞极性消失，细胞间及细胞与基质间的连接结构消失，细胞骨架蛋白重塑，细胞移行及侵袭能力均增强，同时具有十分活跃的增殖和分泌细胞外基质的功能，这些改变都直接参与了肾间质纤维化的发生和发展。转分化中形成的Myof是间质中合成细胞外基质的主要细胞，Myof数目的多少直接决定了肾间质纤维化病变的程度及纤维化进展的速度。
在本实验中观察到，用高糖刺激大鼠肾小管上皮细胞，6 h少数细胞开始表达α-SMA,并持续到72 h。说明高糖刺激肾小管上皮细胞可引起肾小管上皮细胞转分为肌成纤维细胞。而且随刺激时间的延长，发生肌成纤维细胞转分化的肾小管上皮细胞不断增加。72 h后发生转分化的细胞可达到80%左右。TEMT的发生必然会引起肾间质纤维化的发生。可见临床上糖尿病患者血糖控制不良可能是促进糖尿病患者肾脏发生TEMT并最终进展为终未期肾衰的重要原因。因此，严格控制血糖并防止和逆转糖尿病时的TEMT可能成为治疗糖尿病肾病进展为终未期肾衰的重要手段医.学全.在.线网站www.med126.com。
辛伐他汀是目前治疗高血脂的重要药物，最近研究发现其具有抗纤维化作用[3-5]以及影响细胞增殖和分化[13-15]，同时具有肾脏保护作用，推测其肾脏保护作用可能与抑制TEMT有关。因此本研究用辛伐他汀来处理高糖刺激的肾小管上皮细胞，在动态观察的过程中，观察到辛伐他汀能够显著抑制肾小管上皮细胞转分化的发生，虽然并没有完全的抑制TEMT的发生，但这一结果在临床上仍然是非常有价值的。尽管辛伐他汀尚不能完全阻止糖尿病肾病的发生，但至少可以明显的减缓糖尿病肾病进展为终未期肾衰的进程。这将为辛伐他汀在临床上用于糖尿病肾病肾纤维化的治疗提供新的理论依据。同时也说明对这一疾病的治疗，辛伐他汀是不能完全胜任的，应采取综合措施，取长补短以求得最佳疗效。同时实验中虽然证实辛伐他汀具有抑制转分的作用，但没有验证辛伐他汀是否具有逆转TEMT的作用，同时其抑制转分化的作用与药物的作用时间药物剂量之间的量化关系也不清楚，因此辛伐他汀在临床上用于糖尿病肾病治疗的最佳时机以及最佳剂量和疗程等很多问题还有待进一步研究。
