（3)背景染色低：在酶标抗体法中，被标记的非特异性抗体可与组织成分结合，造成背景染色（图4-6)。从理论上讲，在非标记抗体法，连结抗体中，即使存着非特异性抗体，因其不是抗第一抗体种属IgG的特异性抗体，故亦不能与抗HRP抗体结合，不能把PAP复合物连结在此非特异性抗体上（图4-7)。当然，PAP复合物内也可能存在些非抗HRP的抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，但因其不是抗HRP的抗体，故不能与HRP结合，无酶活性。因此说桥抗体的引入，使ICC的特异性得到了双重放大，S/N增大。但也有人认为，过量的桥抗体及PAP复合物等均易与Fc受体结合，致使背景染色增强。实验表明：合适的切片准备、恰当地应用封闭性阻断剂、正常血清以阻断非特异性结合，加之适当地选择抗体稀释度和抑制内源性酶活性，PAP法和间接法二者的背景均相当低。
图4-6 间接酶标抗体法
背景染色增高原因
图4-7 PAP法降低背景的原理
（4)假阴性及其处理：应用PAP法显示抗原含理较多的组织或冰冻切片组织抗原保持良好的标本时，可导致阴性结果，这种现象称为假阴性。Vandesand发现：应用PAP法显示大鼠视上核和室旁核内加压素神经细胞分布时，第一抗体（1：200)染色，加压素含有细胞呈强性。如果取材前24～48h，脑室内注射秋水仙素，阻断轴突运输以增加视上核和视旁核加压素含量，同时组织标本经脱水、透明、再水化等处理以增加抗体的通透性，同样稀释度染色，结果却阴性。进一步实验发现：增加抗体的稀释度，开始出现阳性染色，稀释至1：1500时，染色最强，继续增加抗体稀释度，染色强度则下降。Bigbee（1977)认为假阴性是第一抗体用量过高与组织抗原结合过多，使相邻两个伉体的Fc段间的距离（d)恰好是连结抗体的两个Fab段与之结合的长度，于是连结抗体不存在游离Fab段，仅剩无活性的Fc段，所以不能将PAP复合物连结在与组织抗原结合的第一抗体上，结果阴性（图4-8)。因此，借助PAP法研究组织抗原分布，特别是新鲜组织冰冻切片组织抗原保存较好时，第一抗体尽量用高稀释度，避免假阴性。石蜡切片很少发生这种现象，所以PAP法在石蜡切片的ICC观察中更为常用。
图4-8 示假阴性：组织切片上结合过多的第一抗体，两抗体间的距离d 恰好适于桥抗体的两个Fab段与之结合，无PAP复合物结合的位置
（5)桥抗体：也称连结抗体，它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力。因此，当第一抗体和PAP复合物中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个Fab段之一与第一抗体结合、另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白A（SPA)代替桥抗体，进行ICC染色。SPA不受种属限制，应用范围广。
（6)PAP复合物：在PAP法及酶桥法中，特别强调第一抗体和抗HRP抗体必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起；但一些研究表明：第一抗体和抗HRP抗体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如Erlandsen发现豚鼠IgG作为第一抗体，可用羊抗兔IgG、兔PAP复合物显示之一。Grzanna（1982)根据这一报告，利用豚鼠抗DBH血清作第一抗体，羊抗兔IgG为桥抗体，12例兔血清制得的PAP复合物中，仅3例染色较佳。这种第一抗体和PAP复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体和种属交叉反应是有限的，也是不完全的。故利用桥抗体进行ICC染色时，仍以第一抗体和抗酶抗体来自同一种属为宜。
