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幽门螺杆菌全菌抗原与尿素酶抗原ELISA血清学检测的应用

  大量研究资料证明,幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)是人类慢性胃炎消化性溃疡的重要致病菌且与胃癌的发生密切相关。它可通过胃粘膜活检组织尿素酶试验和Hp培养来诊断其感染,但病人必须接受胃镜检查,由于检查时痛苦较大,更不易被复查和随访患者接受。Hp的尿素酶抗原可刺激机产生高滴度的循环抗体,其中IgG抗体滴度在未经系统抗Hp治疗的人群中,能确切地反映人体内目前有无Hp感染,在感染病人经抗Hp治疗杀灭了体内Hp3~6个月后,IgG抗体滴度能下降25%~50%,因此可客观地反映治疗效果。

  1 材料和方法

  1.1 血液标本

  血液标本676例患者,平均年龄43.5岁(18岁~87岁),主要症状为上腹痛及(或)食后上腹胀、恶心或呕吐、烧灼感染、反酸、嗳气、食欲不振。少数病例经胃镜检查,结果正常胃炎等器质性病变。采取肘静脉血2ml进行检测。

  1.2 Hp尿素酶纯化抗原的制备

  ①菌株选择及细菌培养:实验选择尿素酶活性高的Hp菌,接种含6%脱纤维羊血的布氏平皿中,置混合气体(5%O2、10%CO2和85%N2)环境中,37℃培养3d后收菌。②细菌破碎及预处理:将收集之Hp菌用生理盐水洗2遍后,用凝胶过滤洗脱液将菌稀释至15亿菌/ml,用超声波在冰浴中进行破碎后,经高速离心12000r/min,30min后取上清备用。③凝胶过滤用SephadesG200柱进行,洗脱液测定尿素酶活性并将其活性峰与相应菌全菌蛋白,上柱液及离心沉渣进行SDS-PAGE分析,观察尿素酶提纯效果,Western blot分析是将尿素酶活性峰,经SDS-PAGE将各蛋白分离后,经电泳将蛋白转移到硝酸纤维膜上,处理、染色照相,并记录结果。

  1.3 血清抗Hp尿素酶抗体的检测

  血清抗Hp尿素酶抗体的检测:采用ELISA(按照Kesumen法改良),检测对象为门诊受诊的各类胃病患者共676例,经纯化尿素酶抗原包被的40孔(或96孔)酶标板,用0.5%明胶0.1ml37℃作30min封闭,用洗涤液洗板三次,加入待检血清并以特异性抗HpU抗体的含量为66μg/ml标准阳性血清作为判断村准。加二抗HRP SPA,用PBST20稀释后,每孔加入0.1ml,37℃孵育30min,洗板3次后,在避光条件下与底物液中加入适量30%过氧化氢及邻苯二胺,溶解后,每孔加入0.1ml,37℃孵育,显色5min~10min,加2mol/LH2SO4终止液每孔0.1ml,用49nm波长测吸光度(A)[旧称光密度(OD),下同](或目测)。目测观察:颜色浅于或等于标准阳性对照者为阳性,颜色深于标准阳性对照者为阴性。仪器测定:以酶标仪测定各孔吸光度(A)大于或等于标准阳性对照者为阳性,吸光度(A)小于标准阳性对照者为阴性。当标准性对照吸光度(A)大于或等于0.2时,若阴性对照吸光度(A)小于0.1则试剂盒有效。ELISA特异性经吸收试验鉴定,确定与空肠变曲菌(C.jejuni)、结肠变曲菌(C.coli)及海变曲菌(C.laris)无交叉反应。

  2 结果

  2.1 HpU抗原纯化 

  应用SephadesG200柱,从Hp超声破碎物离心上清液中,一次性提纯了Hp尿素酶抗原。SDS—PAGE分析结果表明,所提取的Hp尿素酶抗原中仅含有66KD及30KD两种蛋白成分,与Hp尿素酶蛋白两种亚基的大小完全相同,提取物中几乎不含有其他杂蛋白成分,经Western blot分析,证明所提纯的Hp尿素酶抗原仍具有良好的抗原性。

  为了检测HpU纯化抗原的敏感性与特异性,实验选择经Hp全菌蛋白抗原对人血清特异性抗Hp-IgG抗体检测的阳性及阴性各类胃病(慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎等)患者血清各50份进行对比研究,结果用混合多型HpU纯化抗原比全菌蛋白抗原为敏感,且特异性高(表1)。

表1 Hp全菌抗原与尿素酶纯化抗原ELISA法检测比较

 

 

Hp全菌抗原

阳性份数

阴性份数

合计

HpU抗原

阳性份数

50

0

50

阴性份数

6

44

50

 

合计

56

44

100

X2=6.38,P>0.025

  2.2 人血清特异性抗HpUIgG抗体的测定:用目测和酶标仪测定胃病患者人群中血清抗HpUIgG抗体。按表2分析,以特异抗HpU抗体的含量为66μm/ml标准阳性血清作为判断标准,ELISA法与免疫印迹分析对照,敏感性为98%,特异性为96%。

表2 676份病人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体ELISA检测结果

 

ELISA

合计

阳性份数

阴性份数

Western阳性份数

375

8

383

Blot阴性份数

19

274

293

合计

394

282

676

  3 讨论

  Hp是人胃内唯一产生高活性尿素酶的细菌,可通过检测胃内尿素酶的活性来诊断Hp感染,现已发展了多种检测方法,如14N尿素酶排泄试验。13C或14C呼吸试验,均有较高的敏感性和特异性,但是以上几种方法均需要特殊的检验设备和技术,不易在基层推广和应用,因此血清中Hp特异性抗体的检测,在检出与Hp相关性胃炎的诊断中尤为重要,与侵入性诊断方法或呼吸试验相比,血清学诊断易为患者接受,而ELISA法则更为常用,若用患者自身菌株作抗原较用标准菌株作抗原在ELISA试验中更能观察到明显的IgG滴度。

  目前应用于ILISA抗原有三类:①全细胞抗原和超声粉碎物抗原;②部分纯化抗原;③高度纯化抗原。Hp全菌细胞和未纯化的细胞超声波粉碎物抗原,用于Hp感染的血清学诊断一般特异性不高。用Hp多种抗原制品的混合物纯化的纯化尿素酶组分抗原,则可获较高的特异性与敏感性。

  实验采用ELISA法对676份人血清进行了抗HpU抗体的检测,以特异性抗HpU抗体的含量为66μg/ml标准阳性血作为判断标准,其敏感性及特异性各为98%及96%。

  对于Hp阳性的慢性胃炎,抗菌治疗是一种新的治疗方法,我们已往研究表明慢性胃炎,尤其是活动性胃炎与Hp感染更是密切相关,在抗菌治疗前后用ELISA法检测血清Hp抗体,抗菌治疗后抗体滴度明显下降,与Hp清除有关,炎症程度减轻(活动性胃炎症消失)具有相关性。非溃疡性消化不良(NUD)是常见的临床症候群,目前对其病因认识尚不清楚,一般认为是多样性(heterogeneous),其中慢性胃炎占很大比例,而与Hp感染密切相关,经胃镜胃粘膜活检有半数以上有Hp存在,故认为Hp在NUD病人中有一定致病作用。人群血清抗HpU抗体ILISA法检查,属于创伤检测,可用作初筛检查,以后随访,可免去病人多次胃镜检查之苦,节省不必要的检查费用,减少交叉感染机会,有较好的依从性(compliance)和可靠性。总之,用血清抗HpU抗体ELISA法检测,对于慢性胃炎及非溃疡性消化不良中Hp抗体的检出,抗菌治疗方案的确定,抗菌治疗方案的随访与评价及流行病学调查研究,是一项简便、可靠、实用的方法。

本课题为国家自科学基金资助项目

陈晶晶1 杨昭徐2 蒋秀高1 张建中1 梁丕霞2

1中国预防医学科学院流行病学微生物研究所(北京102206)

2首都医科大学附属北京天坛医院(100050)

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