网站首页
医师
药师
护士
卫生资格
高级职称
住院医师
畜牧兽医
医学考研
医学论文
医学会议
考试宝典
网校
论坛
招聘
最新更新
网站地图
中医理论中医临床诊治中医药术语标准中国方剂数据库中医疾病数据库OCT说明书不良反应中草药图谱药物数据药学下载
您现在的位置: 医学全在线 > 中医理论 > 中医书籍 > 正文:第二节 动脉血管壁细胞组分的提取
    

动脉粥样硬化:第二节 动脉血管壁细胞组分的提取

一、血管壁细胞提取1.以无菌术取动脉,立即放入4℃、5%水解乳蛋白Hanks液中漂洗,除去凝血。2.用小镊剔除外膜纤维、脂肪组织,用剪子沿血管壁纵向剪开血管,用Hanks液洗2次。3.可先分开内皮细胞和平滑肌细胞,也可不区分两类细胞,将血管切成小块,放入2%胶原酶,温浴…

一、血管壁细胞提取

1.以无菌术取动脉,立即放入4℃、5%水解乳蛋白Hanks液中漂洗,除去凝血。

2.用小镊剔除外膜纤维、脂肪组织,用剪子沿血管壁纵向剪开血管,用Hanks液洗2次。

3.可先分开内皮细胞和平滑肌细胞,也可不区分两类细胞,将血管切成小块,放入2%胶原酶,温浴12~18h。

4.梯度液选择40%~70%,40%梯度液应是4份precoll、1份小牛血清、5份BPS,其他浓度配制与此相同。

5.把密度梯度液按从管底至管口密度梯度逐渐减少的顺序铺入试管,将操作3.细胞液铺于顶层,4kr/min离心,收集各层细胞鉴定。

二、细胞核提取

1.取制备血管细胞悬液放于试管中,加五倍体积缓冲液(10mmol/l Triswww.med126.com/yishi/HCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl2),加1%SDS10 μl用匀浆器轻轻匀浆。

2. 加蔗糖液(0.34mol/L,蔗糖10mol/LMgCl2)2份再匀浆1次,下面铺一层0.88mol/L蔗糖,800g离心5min,收集沉淀部分。

3.在0.88mol/L蔗糖液中再纯化1次,然后将细胞悬于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl2)液中,用超声波处理10S。

4.将两倍体积的0.88mol/L蔗糖加于上述处理液中,800g离心30min收集沉淀部分。

5.将沉淀加入0.88mol/L蔗糖,5kg离心1h,沉淀部分为细胞核,将其保存于0.25mol/L蔗糖,0.55mmol/LMgCl中备用。

三、细胞膜的提取

1.取一定量酶处理的细胞,用匀浆器破碎,操作要温和,使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应,因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压,以每克细胞湿重加40ml介质。

2.用Potter-Elvehiem匀浆器,杆与壁间间隙0.5~0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4~6次,每次5S。

3.过滤匀浆液,150g离心10min,保留上清,沉淀部分加入50μl介质,用匀浆器1kr/min匀浆3次,150g离心10min,沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。

4.合并3次上清液,2kg离心10min,弃上清,沉淀部分溶于100μl介质,离心10min,弃上清,留沉淀。

5.将沉淀部分加入70%蔗糖15份,然后分别置于三个离心管中,上面依次叠加54%、49%、45%,41%,37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。

6.700kg离心90min,分离介质在1.16~1.18之间形成介面。

7.收集d为1.16~1.18g/ml之间的细胞膜,加30倍的介质以2.5kg离心10min,洗涤2次。

8.保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中,用于细胞膜的研究分析。

四、溶酶体的分离

1.在梯度混合器的两个小杯中分别加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖(比例9:1)。

2.收集血管壁细胞,用特制匀浆器1kr/min匀浆10次。

3.以150g离心10min,上清液以同样条件离心1次,弃沉淀,上清液以9kg离心3min弃上清液,

4.沉淀分三种不同颜色,褐色为半纯化的溶酶体,中间黄褐色为线粒体部分,上层白色为膜成分混合物。首先小心吸取上层,然后加入0.3mol/L蔗糖数毫升,慢慢摇匀使界面层悬浮,再用0.3mol/L蔗糖洗1次。

5.将悬浮的半纯化溶酶体铺在梯度平面上,用玻棒搅匀最上层梯度液,使溶酶体和梯度液之间的介面破坏,然后以10kg离心15min,离心后可出现三条明显的区带及少许沉淀,最下面黄褐色为纯化的溶酶体,中间黄色的为线粒体。

五、线粒体的分离

1.浆分离的血管浸入缓冲液(250mmol/L甘露醇、0.5mwww.med126.com/sanji/mol/l EDTA、 5mmol/L Hepes、0.1%BSA、pH7.4)匀浆破碎细胞,600g离心5min,除去细胞核及碎片。

2.上清液在100kg离心10min,留取沉淀部分。

3.将沉淀部分悬浮于5ml操作1.的缓冲液中,加入5倍体积30%Percon、225mmol/L甘露醇、1mmol/L,EDTA、25mmol/LHepes 0.1%BSA,5000g离心30min。

4.将上述沉淀溶于适量10mmol/L KH2PO4,pH7.4中,轻轻振荡15min。

5.加入10ml蔗糖液缓冲液(32%蔗糖、30%甘油、10mmol/l MgCl2、10mmol/L KH2PO4,pH7.4)振荡15min。

6.用BransonB-12超声波碎仪60~70W处理2次,每次15min,12kg离心10min。

7.将沉淀部分溶于10倍体积缓冲液中并铺于试管底层,试管中层铺成不连续蔗糖梯度(25.3%、37.9%和51.3%)蔗糖各4mm厚,上层铺上清液。

8.2kg离心3h,在25.3%/37.9%界面处为线粒体外膜,在51.3%蔗糖层分别回收内膜和基质。

...
关于我们 - 联系我们 -版权申明 -诚聘英才 - 网站地图 - 医学论坛 - 医学博客 - 网络课程 - 帮助
医学全在线 版权所有© CopyRight 2006-2046, MED126.COM, All Rights Reserved
皖ICP备06007007号
百度大联盟认证绿色会员可信网站 中网验证